大肠菌群检测操作规范优质推荐课件.ppt

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1、大肠菌群检测操作规范培训,大肠菌群检测操作规范培训,目录,一、细菌介绍二、大肠杆菌生物学特性三、大肠杆菌检测仪器、设备四、检测培养基及试剂五、检测前培养基准备六、接种培养七、MPN单位介绍八、检测注意事项,目录一、细菌介绍,一、细菌介绍,细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.5m, 0.5-5m），结构简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。,一、细菌介绍细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.,1、细菌的形态,细菌个体微小、形态各异球菌杆菌弧菌与弯曲菌螺旋菌及螺旋体不规则形,弧菌,1、细菌的形态 细菌个体微小、形态各异弧菌,2、细菌的结构,细菌的基本结

2、构包括：细胞壁、 细胞膜、间体、细胞浆、核糖体、细胞质。 细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞。,2、细菌的结构 细菌的基本结构包括：细胞壁、 细胞膜、间体、,3、细菌的繁殖,细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。,3、细菌的繁殖 细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。,4、细菌的菌落,单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团菌落。,4、细菌的菌落 单个或少数细菌细胞生长繁殖后，

3、会形成以母细胞,细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。,细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以,细菌的菌落图,细菌的菌落图,二、大肠杆菌生物学特性,大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。,二、大肠杆菌生物学特性大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、,大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生鞭毛运动或不运动。最适生长温度为37，在42-44条件下仍能生长，生长温度范围为15-46

4、。,大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏阴性、两端钝圆的杆菌，无,1、大肠杆菌平板菌落图片,1、大肠杆菌平板菌落图片,2、大肠杆菌革兰氏染色图片,2、大肠杆菌革兰氏染色图片,3、大肠杆菌微菌落图片,3、大肠杆菌微菌落图片,4、大肠杆菌透射电镜图片,4、大肠杆菌透射电镜图片,5、大肠杆菌扫描电镜图片,5、大肠杆菌扫描电镜图片,85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团菌落。细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成

5、分加倍。无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。另换1根1ml灭菌移液管吸取1:10的稀释液1ml于含有9ml0.3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的MPN值。同时分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型

6、菌落，则挑取典型菌落；1、伊红美蓝琼脂平板分离主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。01ml (10-2浓度)3支。85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。2、接种培养时，先接生理水管，再接乳糖胆盐发酵管。,6、大肠杆菌分裂图片,85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；6、大,三、检测仪器、设备,冰箱：04 恒温培养箱：361 恒温水浴锅：461 微生物显微镜,三、检测仪器、设备 冰箱：04,架盘药物天平：0

7、g500g，精确至0.5g 三角瓶：500ml 灭菌吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径90mm 试管：18180mm,架盘药物天平：0g500g，精确至0.5g,四、检测培养基及试剂,乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂乳糖发酵管革兰氏染色液生理盐水,四、检测培养基及试剂乳糖胆盐发酵管,乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。35g乳糖胆盐于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。,乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。35g乳糖胆盐于1升蒸馏,乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。 30g乳糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，

8、放入小倒管，11515分钟高压灭菌。,乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。 30g乳糖于1升蒸馏水中，,伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板检测。 37.5g于1升蒸馏水中，摇匀，加热煮沸，12115分钟高压灭菌。,伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板检测。 37.5g于1升,五、检测前培养基准备,检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培养基小导管内是否有气体。按产品品种将培养基分别放在试管架内，同时将9ml 0.85%灭菌盐水管也放入相应的试管架内。,五、检测前培养基准备 检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培养,六、接种培养,（一）酸牛奶系列产品酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基9支管，分别接

9、种样品量为1ml (原浓度)3支，0.1ml (10-1浓度)3支，0.01ml (10-2浓度)3支。,六、接种培养 （一）酸牛奶系列产品,1、 1ml接种培养,在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml样品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,1、 1ml接种培养在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml,录像中存在的细节问题：若有产酸产气，则要做证实试验。挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于361的培养箱内培养242h，观察产气情况。灭菌平皿：直径90mm1m

10、l (10-1浓度)3支，0.另换1根1ml灭菌移液管吸取1:10的稀释液1ml于含有9ml0.乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。1、用酒精棉球擦拭操作台，点酒精灯，消毒手，擦拭样品表面并记录，消毒手，消毒剪刀，剪开样品袋。将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。01ml (10-2浓度)3支。食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌群的最近似值，是用MPN来表示。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发

11、酵管。酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基9支管，分别接种样品量为1ml (原浓度)3支，0.3、大肠杆菌微菌落图片85%灭菌盐水管也放入相应的试管架内。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。,2、 0.1ml接种培养,另换1根1ml灭菌移液管吸取1:10的稀释液1ml于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；同时分别吸取1ml 1:10稀释液于3支单料乳糖胆盐发

12、酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,录像中存在的细节问题：2、 0.1ml接种培养另换1根1ml,3、 0.01ml接种培养,另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml 1:100稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,3、 0.01ml接种培养另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1,4、接种过程操作录像检测单料大肠检测.MPG,4、接种过程操作录像检测单料大肠检测.MPG,讨论,录像中存在的问题：1、整个微生物检测前应先消毒手。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯

13、。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。,讨论录像中存在的问题：,5、接种后培养,将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。,5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于361的培,6、结果查询并记录,若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。,6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大,（二）活性乳酸菌饮料系列产品,活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆盐发酵培养基3支管，单料乳糖胆盐发酵培养基6支，分别接种样品量为10ml 3支，1ml 3支，0.1ml 3支。,（二）活性乳酸菌饮料系

14、列产品活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳,1、 10ml接种培养,在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml样品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时用10ml灭菌吸管分别吸取10ml样品试液于3支双料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,1、 10ml接种培养在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1m,2、 1ml接种培养,另用1ml灭菌移液管分别吸取1ml 样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,2、 1ml接种培养另用1ml灭菌移液管分别吸取1ml 样品,3、 0.1ml接种培养,另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml 1

15、:10稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,3、 0.1ml接种培养另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1m,30g乳糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌群的最近似值，是用MPN来表示。将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；三、大肠杆菌检测仪器、设备主要包括埃希氏菌

16、、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。35g乳糖胆盐于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。同时分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。五、检测前培养基准备架盘药物天平：0g500g，精确至0.乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。1、 10ml接种培养,4、接种过程操作录像检测双料大

17、肠检测.MPG,30g乳糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管,讨论,录像中存在的细节问题：1、整个微生物检测前应先消毒手。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。,讨论录像中存在的细节问题：,5、接种后培养,将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。,5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于361的培,6、结果查询并记录,若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。 若有

18、产酸产气，则要做证实试验。,6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大,（三）证实试验,1、伊红美蓝琼脂平板分离将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分别接种于伊红美兰琼脂平板(划线分离)，置于361的培养箱内培养242h。,（三）证实试验1、伊红美蓝琼脂平板分离,接种和分离工具,1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻,平板分离画线法,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,平板分离画线法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法,将伊红美蓝琼脂平

19、板从培养箱取出后,观察菌落形态，并做革兰氏染色和乳糖复发酵试验。革兰氏染色：见革兰氏染色及镜检操作规范。,将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后,观察菌落形态，并做革兰氏染,（四）乳糖发酵试验,挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于361的培养箱内培养242h，观察产气情况。,（四）乳糖发酵试验挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培,凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。,凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠,在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁

20、，这样便产生两个子细胞。另换1根1ml灭菌移液管吸取1:10的稀释液1ml于含有9ml0.在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml样品试液于含有9ml0.恒温培养箱：36185%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；1、 10ml接种培养挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于361的培养箱内培养242h，观察产气情况。另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。大肠菌群检测操作规范培训乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发

21、酵培养基，置于361的培养箱内培养242h，观察产气情况。按产品品种将培养基分别放在试管架内，同时将9ml 0.大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。若有产酸产气，则要做证实试验。4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。1、伊红美蓝琼脂平板分离无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。同时分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。,根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，查找每100ml样品内的大肠菌群的MPN值。,在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞,七、MPN单位介绍,MPN=Most Proba

22、ble Number ，最大可能数 ，是一种利用统计学检测微生物的方法。食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌群的最近似值，是用MPN来表示。,七、MPN单位介绍MPN=Most Probable Num,采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的MPN值。,采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养,八、注意事项,乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。 在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，98%以上

23、为大肠菌群。,八、注意事项 乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管,革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。如果只有红色或粉色菌落，应挑取3个进行革兰氏染色，并接种乳糖发酵培养基。如果有红色和粉色菌落，则各挑取3个做革兰氏染色，各挑取3个接种乳糖发酵培养基混合接种。,革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；无典型,另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml细菌个体微小、形态各异同时用10ml灭菌吸管分别吸取10ml样品试液于3支双料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。二、大肠杆菌生物学特性大肠菌群检测操作规范培训在分裂前

24、先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。01ml (10-2浓度)3支。若有产酸产气，则要做证实试验。4、大肠杆菌透射电镜图片根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，查找每100ml样品内的大肠菌群的MPN值。5、剪刀用完后及时的进行擦拭干净。细菌的基本结构包括：细胞壁、 细胞膜、间体、细胞浆、核糖体、细胞质。1、用酒精棉球擦拭操作台，点酒精灯，消毒手，擦拭样品表面并记录，消毒手，消毒剪刀，剪开样品袋。将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。恒

25、温培养箱：361酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基9支管，分别接种样品量为1ml (原浓度)3支，0.细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。,1ml (10-1浓度)3支，0.1、伊红美蓝琼脂平板分离2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。2、接种培养时，先接生理水管，再接乳糖胆盐发酵管。85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；若

26、所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.4、先熄灭酒精灯再擦拭操作台和酒精灯。将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养242h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的MPN值。3、大肠杆菌微菌落图片三、大肠杆菌检测仪器、设备革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；3、拿刻度吸管时，注意用手托住吸管筒轻轻抖出。若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性

27、。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。架盘药物天平：0g500g，精确至0.2、为了尽量减少污染，接种培养时先接生理盐水管再接乳糖胆盐发酵管。大肠菌群检测操作规范培训,大肠杆菌接种培养流程,1、用酒精棉球擦拭操作台，点酒精灯，消毒手，擦拭样品表面并记录，消毒手，消毒剪刀，剪开样品袋。2、接种培养时，先接生理水管，再接乳糖胆盐发酵管。双料的先接生理盐水管，接1ml原样，再接10ml 的原样。3、操作完后，先熄灭酒精灯再消毒操作台和擦拭酒精灯外周。,另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml1ml (10-1浓度,