常见风湿病实验检查培训课件.ppt

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1、常见风湿病实验检查,常见风湿病实验检查,BS HLA-B51.PMDM HLA-B8,DR3,DR1. HLA-DRB1 ，ancestral haplotype祖单倍体 8.1。TNF-308ASSC HLA-DR1,DR5,DRQI；P1A2/FN等位基因与肺纤维化，Scl-70的阳性呈正相关。SS HLA-DR3. DRBI0602，03（与肾小管酸中毒及SSB密切相关，DQAI0504，DQBI0202。RF HLA-DR4.OA HLA-A1,B8.,3,2,常见风湿病实验检查,BS HLA-B51.32常见风湿病实,HLA研究进展,HLA抗原基因的多态性，决定了其所表达的HLA抗原

2、分子的多态性， 也决定了HLA系统免疫应答的多样性与复杂性。近年来HLA 基因分型迅猛发展，使得HLA 基因分型更加准确，简便和实用。 HLA 基因分型目前大致分为： 限制性片段长度多态性方法PCR- RFLP (restriction fragment length polymophism)。PCR- SSOP 是以核酸杂交为基础的分型技术。 PCR扩增特定的基因片段，与(sequence specific oligonucleotide probes)序列特异性寡核苷酸探针杂交，进行分析鉴定。 基因芯片或微阵列技术 (gene chip or DNA microarray)：,3,3,常见

3、风湿病实验检查,HLA研究进展 HLA抗原基因的多态性，决定了其所表,该技术其原理类似于反向斑点杂交。它是指大规模集成电路控制的机器人在尼龙膜或硅片等固相支持物的表面有规律地合成代表不同基因的寡核苷酸探针，或液相合成探针后，通过点样仪点样于固相支持物的表面。这些探针与放射性标记物或荧光素标记的样品的DNA或 cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，反映样品中基因表达的情况。 PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)可检测DNA 片段中不同位置的点突变，而不必

4、象PCR- RFLP 那样，必须选择合适的限制酶，使其识别的位点正好位于等位基因的特异性核苷酸序列处。,3,4,常见风湿病实验检查,该技术其原理类似于反向斑点杂交。它是指大规模集成电路,PCR- SSP(SEQUENCE SPECIFIC PRIMES)是近年唯一针对急诊和尸体器官移植而设计的。其原理是通过序列特异性引物SSP ，特异的扩增目的DNA 片段，再通过凝胶电泳等手段，判断被扩增序列的存在。作为第3代遗传标记SNP单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphism)。已有MHC-SNP分型试剂盒面市。分子的超型及抗原结合肽超基序的发现，表明可从功能上对类分

5、子进行分类使得该技术更为合理，简明和实用，对于疾病相关性的研究和异体移植有重大意义。,3,5,常见风湿病实验检查,PCR- SSP(SEQUENCE SPECIFIC P,AS的相关遗传因素,1：HLA是一必需的致病基因，但其遗传风险为1650%。其亚型有23个之多，从B27012723。与AS相关的是270527042701等等。2：CYP2D6LMP7和TNF308等TNF-的等位基因；bosak报道HLA-2Bw4Cw1/2DR1基因频率均高于健康人群。这提示HLA-ABCDR和DQ区域有与AS发病的易感基因存在；HLA-B60增加了AS依赖HLA-B27发病的易感性。,3,6,常见风湿

6、病实验检查,AS的相关遗传因素1：HLA是一必需的致病基因，但其遗传风险,链球菌感染的检测 1 咽拭子培养 2025%SZ(链球菌酶)检 2ASO500 50% 3DNA酶-B210 85% 4ASK(抗链球菌激酶)8 5AH(抗透明质酸酶)128 6ANDS(抗核苷酸)275抗EBV抗体 RAPHS-2(福氏志贺菌) Reiters肺炎克雷伯菌 AS 沙门菌,螺杆菌 ReA,3,7,常见风湿病实验检查,链球菌感染的检测 37常见风湿病实验检查,炎性实验室指标,主要针对疾病活动性ESR:CRP:2周内80%, 大于4周25%OTHER:1.白细胞及中性粒细胞. 2.糖蛋白及粘蛋白等.,3,8,

7、常见风湿病实验检查,炎性实验室指标主要针对疾病活动性38常见风湿病实验检查,CRP,IL-1IL-6TNFa,TGPF4,白细胞粘着游走,CRP,凝血纤溶系统亢进,ICAM-1VCAM-1E-SELECTIN,血小板凝集亢进,血小板释放反应,感染外伤免疫异常恶性增生物,3,9,常见风湿病实验检查,CRPIL-1TG白细胞CRP凝血纤溶ICAM-1血小板血,CRP与炎症,CRP是重要的炎性因子,其致炎作用包括:激活补体、刺激细胞因子分泌、上调内皮细胞黏附分子表达、抑制一氧化氮合成、增加纤溶酶原激活物抑制剂-1的水平与活性、增强巨噬细胞对低密度脂蛋白的摄取及单核细胞化学趋化性、上调血管紧张素-1型

8、受体的表达等.CRP与肥胖关系密切,而且脂肪细胞也可分泌CRP.CRP水平随年龄的增高而升高,女性较高,吸烟、感染和某些药物可使其增高;而饮酒和某些药物可使其降低.,3,10,常见风湿病实验检查,CRP与炎症CRP是重要的炎性因子,其致炎作用包括:激活补体,生化检查,1.Ca, P,Fe等电解质.2.UA,磷酸钙双水化合物CPP等. 3.肝, 肾,血常规等功能检查.4.CPK,LDH同功酶，肌球蛋白，肌凝蛋白重链，肌钙蛋白I（TnI），等肌酶谱检查.5.蛋白及蛋白电泳检查.6.雌激素,泌乳素等激素检查.7.维生素,骨钙素,TRAP,Pyd,Dpyd等.,3,11,常见风湿病实验检查,生化检查1

9、.Ca, P,Fe等电解质.311常见风湿病实验,雌激素和催乳素PRL,大家都知道神经-内分泌-免疫调节网络功能失调，会影响的发生和发展。 PRL（prolatin）已被证明具有免疫调节作用，对细胞和体液免疫都有促进作用，而且免疫细胞也能产生PRL样物质，发挥自分泌和旁分泌作用。大量研究表明在SLE中PRL与可的松CS比值增高反与病情进展相关。男性患者PRL水平升高而雄激素功能低下，认为PRL可抑制睾酮的生成，在病因中起作用。但也有人认为不是通过其抑制雄激素而起作用。另外用bromocriptine BRC溴隐停使PRL降低可使SLE病情改善。在RA已证明PRL是AA（adjuvant art

10、hritis）形成的必要条件。国外报道在RA中PRL水平上升发生率为10.8%。,3,12,常见风湿病实验检查,雌激素和催乳素PRL 大家都知道神经-内分泌-,SS，PA，Reiter等风湿病都有PRL水平升高。目前认为1.可能与可诱导核细胞产生IgM，IgA，IgG，ds-DNA和ANA及IgM类RF，ANA滴度增加并且PRL水平与ANA相平行。IgG类ds-DNA与抗甲状腺微粒体抗体TMA合成增加，同时伴ESR增快，淋巴细胞减少。2.PRL基因在第6号染色体短臂上，与HLA基因复合体非常近。生殖危险因子与RA病因相互作用可能是其原因。SLE女性患者HLA-DRB10301和PRL基因之间的

11、连锁不平衡也是原因之一。3.降低甾类物产生的允许作用。PRL水平升高在甾类激素分泌减少的情况下起重要作用。一方面糖皮质激素能拮抗PRL的刺激作用，而性激素对免疫的调节作用随性别而异。另一方面PRL可影响甾类激素的产生，也可拮抗糖皮质激素的抑制作用。,3,13,常见风湿病实验检查,SS，PA，Reiter等风湿病都有PRL水平升高。目前认为,4.PRL与细胞因子 PRL和IL-2在免疫方面起协同作用，从而促进AID的发生。同时PRL也可促进滑膜纤维母细胞的增殖，并促进IL-6，IL-8的生成。而雌激素和雌激素受体在免疫调节和对许多风湿病发病机制，自身抗体的产生，及对其病理进程的影响巨大。早已为众

12、人所熟悉。,3,14,常见风湿病实验检查,4.PRL与细胞因子 PRL和IL-2在免疫方面起协同作用,滑液正常值,PH 7.3-7.43 7.38WBC(/L) (13180) 63 N 0-15 7 L 0-78 24 单核细胞 0-71 48 滑膜细胞 0-12 4蛋白质(g/L) 12-30 18 P(%) 56-63 60 A(%) 37-44 40透明质酸盐(g/L) 3,3,15,常见风湿病实验检查,滑液正常值PH 7,常见风湿病实验检查培训课件,滑液表现,I II III IVOA RA 细菌性 创伤肢端肥大症 AS 结核性 骨折骨坏死 PA 淋球菌 血友病Paget病 SS 神

13、经病性患节炎SLE PM/DMNPA BDSSC WGWilson RF淀粉样变 REA结节性红斑 IBD软骨病 白血病激素治疗 一部分细菌性,3,17,常见风湿病实验检查,滑液表现 I,分子生物技术,1.目的DNA的来源 从组织或细胞中提取. 通过载体获得DNA片段. 以为mRNA模板利用逆转录酶合成互补DNA(cDNA). DNA合成:通过ligation,PCR,probe来完成.2.重组DNA技术:分子构建,细胞转移,宿主细胞鉴定.3.核酸测定和应用DNA/RNA印迹,PCR,原位/斑点杂交.DNA序列测定.,3,18,常见风湿病实验检查,分子生物技术1.目的DNA的来源318常见风湿

14、病实验检查,ANAs,ANA是指抗细胞内DNA,RNA,AHA,no-AHA,phospholipid蛋白质分子及其复合物成分的抗体.Miescher于1957年发现。1957年Ceppelini发现DNA :ssDNA,dsDNA.AHA:H1,H2A,H2B,H3,H4.ENA:Sm,Nrnp,rRNP,SSA/SSB,ScL-70,Jo-1,PM-1,PCNA,RA33,centromere.,3,19,常见风湿病实验检查,ANAsANA是指抗细胞内DNA,RNA,AHA,no-AH,DNA研究,DNA大分子可以存在于循环中或黏附于多种器官的微血管结构，这些循环或器官原位抗原型DNA均可

15、以与循环抗dsDNA自体抗体发生反应，形成抗原抗体免疫复合物，激活炎症系统，如补体途径。在器官引起 免疫复合物介导的疾病，引起关节炎，血管炎，肾炎等临床表现。dsDNA抗体水平于疾病活动性，特别与LN有密切关系。也可作为临床复发的指标。 SLE中的抗DNA抗体是异基因的。血清的抗体和单克隆抗DNA抗体可识别不同分子的核酸表位，如磷脂，蛋白，多糖和细胞结构。这说明DNA本身不可能做为免疫原来诱导DNA抗体产生。同时这种抗体的多反应性可能与个体Ig的不同区域的多结合位点或不同抗原的相同表位有关。,3,20,常见风湿病实验检查,DNA研究 DNA大分子可以存在于循环中或黏附于多,抗DNA抗体的产生与

16、NO有关，活性氧可在细胞分裂中期导致淋巴细胞染色体损害和断裂，使淋巴细胞功能失常或凋亡，释放大量核抗原产生自身抗体。 NO在SLE中参与产生自身抗体，NO抑制粒细胞活性，诱导其凋亡，抑制吞噬细胞释放促炎介质，抑制T细胞增殖和IL-2释放，阻止T辅助细胞分化Th1细胞，导致细胞免疫功能低下，大量自身抗体产生。在凋亡期间完整的核抗原的大量释放可以提供细胞外足够的核抗原来促进免疫反应，诱导抗体的产生。,3,21,常见风湿病实验检查,抗DNA抗体的产生与NO有关，活性氧可在细胞分裂中期导致淋巴,DNA免疫,哺乳动物具有免疫学特性温和，结构简单的特点，单纯的DNA分子不能有效诱导免疫反应，抗哺乳动物的D

17、NA抗体产生与抗原的交叉反应或多克隆B细胞的活化有关。而细菌DNA由于免疫原性强，结构复杂，能有效地诱导机体对宿主自体细胞以外的DNA序列区域直接产生免疫应答。SLE病人抗DNA抗体主要是Ig1和Ig3而且需要T细胞参与，且与所有DNA的保守序列结合。这与健康人的抗DNA抗体（Ig2）不同.通过基因重组技术，将编码有特定蛋白抗原的裸露的质粒DNA注入体内，表达出抗原蛋白，诱导其抗体的表达及T细胞依赖的细胞裂解等一系列特异性免疫应答。DNA免疫不仅可以诱导体液免疫还可诱生特异性的以CTL为代表的细胞免疫应答。,3,22,常见风湿病实验检查,DNA免疫哺乳动物具有免疫学特性温和，结构简单的特点，单

18、纯的,OTHER ANTIBODY,RA: Sa99%, AKA（抗角质蛋白抗体）95%-100%, APF（抗核周因子）40%-50%, AFA（抗聚角蛋白微丝蛋白抗体）为的共同抗原决定族。 RF(IgG,IgM,IgA)80%, RA3389.8%. CCP（抗环瓜氨酸肽抗体）46.6%（96.6%），其中IgG型为53%，IgM型为58%。A-p68A（为糖蛋白成分GRP，也称免疫球蛋白结合蛋白Bip binding protein；实际上是一种内质网分子伴侣。）67.8%;91.3。常见于RF阴性患者并出现于RA早期。SLE: ds-DNA40-90%, AHA3080% , Sm35

19、% , Nrnp20-35% , SSA25-40%, SSB10-15%, hsp40-50%, APL20-50%.anti-neuronal antibodies，anti-N（ 血清中62.0%。脑脊液中47.4%）,3,23,常见风湿病实验检查,OTHER ANTIBODYRA: 32,抗细胞膜DNA自身抗体（autoantibidies to membrane associated DNA，抗 mDNA。）90.0%（98.8%）；AuA（以Ds-DNA和AHA为靶抗原）；抗端粒抗体（抗原为真核细胞末端DNA中高度重复的TTAGGG/CCCTAA序列）60%（91%）。C1qAb（

20、42. 86%；有肾损害为8 8. 33%）。CRPAb与SLE的SLEDAI总IgG/dsDNA滴度呈正相关。PM/DM: Jo-1 18-20%, pl-73,SRP4%, Mi-28%, 56000 85-90%.,3,24,常见风湿病实验检查,抗细胞膜DNA自身抗体（autoantibidies to,SSc:Scl-70 5707%, ACA19.4%. ，抗RNA聚合酶RNAPs I II III，AECA（抗内皮细胞抗体）IgG型为40%，抗原纤维抗体是重症的一个指标，抗丙酮酸脱氢酶的Ela亚单位的抗体是发生胆汁性肝硬化的血清指标。PM-Scl。SS: SSA45-68%, SS

21、B20-33.6%, 抗甲状腺细胞抗体50%, 抗唾腺管细胞抗体10-70%, 抗胰管细胞抗体6-33%, 抗胃黏膜细胞抗体5-15%,抗线粒体抗体20%.,3,25,常见风湿病实验检查,SSc:325常见风湿病实验检查,MCTD: ANA100%, nRNP100%.RF: PCA87%, IgM/IgG抗多糖抗体87%. ANCAANCA(anti neutrophil cytoplasmic antibodies) 是1982年由Davies等人发现的。是针对中性粒细胞主要颗粒成分及单核细胞溶酶体的其主要抗原成分有蛋白酶3（PR3），髓过氧化物酶（MPO）组蛋白酶(CG)，乳铁蛋白(LF

22、)，杀菌/通透性增加蛋白(BIP)，人白细胞弹力蛋白酶(HLE)，溶酶体膜糖蛋白等。,3,26,常见风湿病实验检查,MCTD:326常见风湿病实验检查,其检查方法用间接免疫荧光(IIF)和抗原特异性酶联免疫吸附(ELISA)。分为C-ANC（Atypical）即弥漫的胞浆荧光无中心小叶间增强现象， C-ANCA典型的颗粒状胞浆荧光伴中心小叶间增强现象,P-ANCA核周荧光伴和不伴核延伸，包括粒细胞特异性抗核抗体(GSANA)； AtypicalANCA其他形式的免疫荧光模式。ANA，ACA等抗体常常产生P-ANCA样的免疫荧光模式。,3,27,常见风湿病实验检查,其检查方法用间接免疫荧光(II

23、F)和抗原特异性酶联免疫吸附(,ANCA的致病机制：1.直接激活中性粒细胞2.激活单核细胞3.直接损伤内皮细胞4.激活T淋巴细胞5.a-AT（a-胰蛋白酶）是PR3蛋白酶的抑制剂，AT基因在小血管炎中成多态性。Vasculitides: ANCAChurg-Strauss 64-75%Microscopic polyangiitis 75%WG 90-97%GCA (APL) 30%Takayasu artertis (抗主动脉抗体)1:32BD APL ANCA+,3,28,常见风湿病实验检查,ANCA的致病机制：328常见风湿病实验检查,血管炎的抗体,1 ANCA：2 AECA（anti-endothelial cell antibodies，AECA）: BD 40%; TA37%;MPA36%;PA44%;C-S33%;GCA50%;OTHER62%.3 anti-PR3(蛋白酶3，) anti-MPO(髓过氧化物酶）,3,29,常见风湿病实验检查,血管炎的抗体1 ANCA：329常见风湿病实验检查,其他：内皮素ET-1，致炎因子IL-1/TNF等；趋化因子MIP- 1， MCP-1，RANTES等。新喋呤。sTNF-55，软骨低聚质蛋白（COMP）。黏附分子等等。,3,30,常见风湿病实验检查,其他：内皮素ET-1，致炎因子IL-1/TNF等；趋化,