复习DNA重组技术的基本工具ppt课件.ppt

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1、一、基因工程的概念理解1.供体：提供_2.操作环境：_3.操作水平：_4.原理：_5.受体：表达目的基因6.本质：性状在_体内表达7.优点：克服_障碍，定向改造生物_,目的基因,体外,分子水平,基因重组,受体,远缘杂交不亲和,性状,一、基因工程诞生的理论基础1基因拼接的理论基础(1)DNA是生物的主要遗传物质。(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。,化学本质相同，都是DNA；基因与质粒的结构相同,2外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。(3)生物界共

2、用一套遗传密码。,胰岛素基因重组后能在细菌细胞内表达，还说明所有生物共用一套遗传密码,二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶（简称：限制酶）（1）来源：主要从_生物中分离纯化出来。议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？答案：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。,原核,（2）作用：识别特定的_并切开相应两个核苷酸之间的_。,核苷酸序列,磷酸二酯键,（3）结果：产生_或平末端。,黏性末端,2.DNA连接酶（1）种类：按来源可分为EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（2）作用：在两个核苷酸之间形成_以连接_。,两段DNA片段,磷酸二酯

3、键,3.载体（1）种类：_、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 能_ 有一个至多个_ 有特殊的_【点拨】提取目的基因和切割载体使用同一种限制酶，目的是能形成相同的黏性末端，形成重组DNA分子。,质粒,自我复制,限制酶切割位点,标记基因,2）质粒 特点,(3)作用：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(4)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。,基因工程的工具,1.与DNA相关的酶（1）五种DNA相关酶的比较：,DNA分子,磷酸二酯键,黏性末端或平末端,DNA片段,磷酸二酯键,重组DN

4、A分子,脱氧核苷酸,磷酸二酯键,子代DNA,DNA分子,DNA分子,碱基对间的氢键,磷酸二酯键,形成脱氧核苷酸单链,游离的脱氧核苷酸,DNA(水解)酶,（2）限制酶和DNA连接酶之间的关系图示：,2.作为载体的条件,【高考警示钟】 1.切割质粒需使用限制酶1次，切割目的基因则需要使用相同的限制酶2次。因为质粒是环状DNA，而目的基因在DNA分子链上。 2.质粒DNA分子上限制酶切割位点的选择必须保证至少有一个标记基因是完整的，如果标记基因全部被切开则不便于鉴定与选择。3.基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，膜载体是蛋白质，与细

5、胞膜的通透性有关。,【典例训练1】我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因IPA1。研究发现，基因IPA1发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的IPA1基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加10以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图回答：,（1）上图所示流程中步骤是实验所用技术的核心步骤。此步骤使_ 和_构成_，常用的工具酶是_。,突变的IPA1基因,Ti质粒,重组DNA,限制性核酸内切酶、DNA连接酶,（2）若要在体外扩增IPA1基因可采用PCR技术。标准的PCR过程分为三个步骤，第一步

6、是“变性”即解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在_的作用下完成的（3）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属于可遗传变异中的_ 。（4）过程应用的主要生物技术是_。,DNA解旋酶,基因重组,植物组织培养,【解析】图中为基因表达载体的构建，把目的基因和载体用同种限制性核酸内切酶切割，在DNA连接酶的作用下，构成重组质粒；PCR过程中第一步的变性就是“解旋”，在体外是通过加热使DNA解旋，在细胞内则是在DNA解旋酶的作用下完成的；基因突变发生于重组前，重组细胞中组合的是突变后的IPA1基因与水稻DNA；过程为胚细胞发育成植株的过程，应用的技术为植物组织培养技术。,答案：（1） （重组质粒）（2）（

7、3）（4）,【解题指南】1.知识储备熟悉DNA重组技术操作过程需要的工具，包括相关的酶和载体，及相关酶的作用特点。2.解题思路（1）首先明确目的基因与载体形成重组质粒的过程需用的酶及 该过程的原理；（2）明确由胚细胞发育成完整植株所用的生物技术。,三、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取（1）目的基因：编码蛋白质的_。 从_中获取（2）获取方法 利用_扩增目的基因 通过_用化学方法直接 人工合成,基因,基因文库,PCR技术,DNA合成仪,2.基因表达载体的构建基因工程的核心（1）由图可知载体的组成：_、启动子、终止子、_ _。（2）构建目的： 使_在_中稳定存在，并且可以遗传给下一代； 使

8、_能够表达和发挥作用。,目的基因,标记,基因,目的基因,目的基因,受体细胞,3.将目的基因导入受体细胞（1）转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持_的过程。（2）常用方法 ： 导入植物细胞:_、基因枪法、花粉管通 道法 导入动物细胞:_ 导入微生物细胞:感受态细胞法（或Ca2+处理法）,稳定和表达,农杆菌转化法,显微注射技术,4.目的基因的检测与鉴定（1）_目的基因的有无（2）分子杂交技术_（3）_目的基因是否翻译（4）生物性状的表达与否目的基因是否表达（个体水平）【点拨】启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：启动子、终止子在DNA 上,在遗传信息转录时起调控作用；而起始密码

9、子、终止密码子在mRNA上,在翻译时起作用,决定翻译的开始和结束。,分子水平,DNA分子杂交技术,目的基因是否转录,抗原抗体杂交,【互动探究】（1）图中将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是什么？提示：农杆菌转化法。分析：将目的基因导入植物受体细胞常用农杆菌转化法。将目的基因导入动物受体细胞常用显微注射技术。（2）如何检测导入水稻新品种植株的目的基因是否表达？提示：进行抗原抗体杂交法。分析：检测导入的目的基因是否表达常用抗原抗体杂交法或进行个体水平的检测。,基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取（1）从基因文库中获取目的基因：如从基因组文库或cDNA文库 中获取。（2）利用PCR技术扩增目的

10、基因：利用DNA复制的原理在体外特 异性的复制某DNA片段以获得呈指数方式增加的目的基因。（3）人工合成法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,2.基因表达载体的构建（1）基因表达载体组成： 启动子、终止子:是基因转录的起点和终点，在转录过程中 起调控作用。 标记基因:作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从 而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因。 目的基因：能控制特定性状的外源基因。,（2）基因表达载体的构建步骤：,载体(质粒),同一种限制酶切割,带有黏性末端切口,带有相同黏性末端的目的基因片段,重组DNA(环状重组质粒),DNA连接酶,DNA分子(含目的基因),3.将

11、目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法,显微注射技术,感受态细胞法,体细胞,受精卵,原核细胞,将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达,将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物,Ca2+ 处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,4.目的基因的检测与鉴定,【高考警示钟】 1.目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。2.基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端

12、连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。,【典例训练2】（2011山东高考改编）人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。,（1）图中的高血压相关基因作为_，质粒作为_， 二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上 含有_有关。（2）重组DNA导入的受体细胞是大鼠的_细胞，常用的 方法是_。在DNA重组过程中核心的操作是_。（3）子代大鼠如果_和_，即可分别在分子 水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用 其建立高血压转基因动物模型。（4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程 技术是

13、体外受精、早期胚胎培养和_。,【解题指南】1.考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.解题关键高血压相关基因与质粒形成重组DNA后导入到受精卵细胞中，是DNA重组技术。【解析】（1）根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠”推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。（2）重组DNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组DNA分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体的构建是整个过程中的关键。,（3）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水

14、平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。 (4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。,答案：（1）目的基因 载体 同一种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的切割位点（2）受精卵 显微注射技术 基因表达载体的构建（3）检测到相应蛋白质已患高血压（4）胚胎移植,【互动探究】（1）如果把鼠换成植物，则导入受体细胞的常用方法改变吗？提示：变成农杆菌转化法。分析：植物细胞与动物细胞具有不同的特点，导入的方法是根据操作的需要进行的，如利用农杆菌易

15、感染植物的特性。（2）分子水平检测除蛋白质检测外还有什么检测方法?提示：DNA分子杂交、核酸分子杂交。分析：利用DNA探针检测目的基因或相应的mRNA存在与否，说明目的基因是否存在或是否转录。,1.（2012福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最新研究发现，一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450和GsT)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：,（1）获得油菜素内酯基因的方法

16、有_（举二项即可）。第步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_。步骤用到的酶有_。,（2）图中导入重组质粒的方法是_。在导入之前 应用_处理。（3）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用 _制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养 基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。（4）请你为该课题命名_。（5）请你说说该研究发现的生态学意义： _ _。,【解析】（1）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方法有：从cDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用PCR技术扩增等。PCR技术中耐高温的酶是DNA聚合酶（Taq酶）。步骤是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制

17、酶和DNA连接酶。（2）将重组质粒导入受体细菌中，采用Ca2+转化法，导入前应用CaCl2溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细菌细胞壁的通透性。（3）对目的基因进行检测和筛选中应用红霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（4）课题命名可以是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解。（5）该项研,究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康。答案：（1）从cDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用PCR技术扩增（任答两项即可） Taq酶 限制酶和DNA连接酶（2）Ca2+转化法 氯化钙溶液（3

18、）红霉素抗性基因红霉素 （4）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解（5）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康,2.(2010福建高考)红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO），其简要生产流程如图。请回答：,（1）图中所指的是_技术。（2）图中所指的物质是_，所指的物质是 _。 （3）培养重组CHO 细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产 物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_。（4）检测 rhEPO的体外活性

19、需用抗rhEPO的单克隆抗体。分泌 该单克隆抗体的_细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。,【解析】本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用PCR扩增技术、用反转录法、用化学合成法），由图以核DNA为模板获得目的基因的方法可知为PCR技术。进行反转录的模板是mRNA。由题意可知重组CHO细胞适用于生产重组人红细胞生成素(rhEPO），所以重组CHO细胞能够表达出重组人红细胞生成素(rhEPO）或者红细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从培养液中

20、吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆抗体是让B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂交瘤细胞来分泌抗体。,答案：（1）PCR （2）mRNA rhEPO （3）培养液 （4）杂交瘤,3.(2011海南高考)回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA 后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限 制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_（相同、不同）黏性末端的限制酶。,（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的

21、作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用抗原抗体杂交技术。（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_上。,【解析】（1）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。（2）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原抗体杂交技术。（3）基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把目的基因插入到染色体的DNA分子中。答案：（1）平 相同（2）RNA聚合酶识别和结合的部位 Ca2+ 分子杂交技术 蛋白质（3）T-DNA 染色体DNA,4.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：,