动物组织RNA提取及荧光定量PCR精讲ppt课件.ppt
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1、RNA提取及Q-PCR相关技术,主讲:宋志新,利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA,是目前常用的RNA提取方法。Trizol(主要成分为异硫氰酸胍和酚),具有极强的裂解能力,可在短时间内裂解细胞和组织样本,保持样品中RNA的完整性,有效抑制RNA的降解。样品在Total RNA Extraction Reagent中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层),RNA分布在上层水相中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。提取的总RNA纯度高,基本不含蛋白质及基因组DNA,提取的RNA可直接用于Northern,点杂交,
2、mRNA纯化,体外翻译,RT-PCR,以及构建cDNA文库等各种分子生物学实验。Total RNA Extraction Reagent广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物等。下面介绍动物组织Total RNA的提取方法,RNA提取,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,概要,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,实验材料1、组织(以小鼠肝脏为例)2、RNAiso Plus(Code No: 9108)(作用同TRIzol)3、其他:氯仿、异丙醇、75%乙醇、研钵、加样器、1.5ml EP管、枪头等。(均为RNase-free),0.1%DEPC水
3、,有毒,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,准备工作戴口罩、手套、帽子提取区域:用75%乙醇擦拭试验台试验器具:用75%乙醇擦拭加样枪 准备RNase-free的枪头和离心管 低温离心机预冷至4 准备-20预冷的75%乙醇,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤1、从小鼠体内取出肝脏,用预冷的生理盐水清洗。2、使用液氮迅速冷冻组织, -80冰箱保存。3、使用液氮充分预冷研钵。4、将称重冷冻的组织(约50-100mg)从冰箱取出后迅速放入预冷好的研钵中,用研杵研磨组织,期间不断加入液氮,直至组织被研磨成粉末状。(注
4、:无明显的可见颗粒,如果研磨不彻底会影响RNA的收率和质量。),RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤5、向研磨成粉末状的样品中加入1ml RNAiso Plus,并完全覆盖样品。(注:在加入RNAiso Plus时要保证组织没有融化,否则RNA易被RNase降解。)6、室温静置510 min。7、待样品融化后,用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至1.5ml EP管中,室温静置5 min后,4,13000rpm离心5 min,将上清转移至新的1.5ml EP管中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,R
5、NA的提取步骤8、每1ml液体中加入1/5体积(约200l)的氯仿,盖紧EP管,用手剧烈震荡15秒,直至溶液充分乳化,无分相现象。(注:不能用振荡器混匀,因为容易造成DNA和RNA的物理降解。)9、室温静置5 min,4,13000rpm离心15 min。10、从离心机中小心取出EP管,此时匀浆液分为三层,上层是透明的水层,RNA溶解在此层中;半固体状的中间层,此层中包含DNA;下层为粉红色的有机溶剂,蛋白质、多糖等物质溶解在此层中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤11、将上层水相溶液小心转移至新的EP管中,大约每个EP管中能取出4005
6、00l,谨慎操作,切勿吸到中间层。(注:下层有机废液勿乱丢,收集起来统一进行无毒化处理。)12、加入等体积异丙醇,上下颠倒EP管,充分混匀。13、室温静置10 min后,4,13000rpm离心10 min。可在离心后的EP管底部观察到少量的白色沉淀。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤14、小心弃去上清。15、向含有沉淀的EP管中缓缓加入1ml预冷75%乙醇,轻轻上下颠倒,清洗沉淀。(动作轻柔,无需将沉淀悬浮起来)16、4,13000rpm离心5 min。用移液器除去上清。17、将EP管瞬时离心,用移液器仔细将残存在EP管底部的少量液体除去
7、。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤18、打开EP管,室温放置干燥(目的是让残留的乙醇挥发,乙醇的残留可能对后续的反应有影响)。干燥的时间不宜太久,RNA完全干燥后很难溶解19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。(视RNA量的多少所加RNase-free ddH2O的体积从20-200不等,肝脏组织RNA产率较高,肺组织产率低)20、RNA溶液保存在-80冰箱中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测1、浓度及纯度检测:(Thermo SCIENTIFIC NANODROP
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