十二章固相膜免疫测定课件.ppt

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1、第十二章固相膜免疫测定,第十二章固相膜免疫测定第十二章固相膜免疫测定 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。2021/4/272,第十二章固相膜免疫测定第十二章固相膜免疫测定第十二章固相膜免,随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。,2021/4/27,2,随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上,第一节 概述,标记免

2、疫测定放射免疫测定 1960酶免疫测定 1970荧光免疫测定 19801990化学发光免疫测定 1990膜固相免疫测定 1990,2021/4/27,3,第一节 概述,一、免疫测定分类,免疫浊度测定Ag + Ab AgAb + Ab标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）,2021/4/27,4,一、免疫测定分类免疫浊度测定2021/4/274,二、免疫测定原理,利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab Ag * Ab,2021/4/27,5,二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质2021/,三、固相免疫测定,B与F

3、分离,Ab* Ab*Ag + Ag + Ab* Ab Ab,2021/4/27,6,三、固相免疫测定B与F分离 Ab*,四、固相膜的特点,多孔性 毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性易于漂洗 操作简便,2021/4/27,7,四、固相膜的特点2021/4/277,五、常用的固相膜,玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜,2021/4/27,8,五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜2021,六、固相膜的技术要求,孔径：0.20

4、.6 m流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cm2表示均一性,2021/4/27,9,六、固相膜的技术要求孔径：0.20.6 m2021/4/,第二节免疫金标记技术,免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。,2021/4/27,

5、10,第二节免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immuno,一、胶体金制备,胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。,2021/4/27,11,一、胶体金制备胶体金（colloidal gold）的制备,胶体金的制备及特性,*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量,2021/4/27,12,胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（,胶 体 金（Colloidal Gold）15

6、60 nm,优 质,劣 质,2021/4/27,13,胶 体 金（Colloidal Gold）1560 n,胶体金结合物（Conjugate）,2021/4/27,14,胶体金结合物（Conjugate）2021/4/2714,膜固相免疫测定的特点,第三节膜载体免疫测定的种类与原理,2021/4/27,15,膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不,固相微孔膜测定种类,斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）斑点ELISA (dot enz

7、yme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA),2021/4/27,16,固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dot immunog,一、免疫渗滤测定(IFA),2021/4/27,17,一、免疫渗滤测定(IFA)2021/4/2717,IFA双抗体夹心法测抗原,2021/4/27,18,IFA双抗体夹心法测抗

8、原AB2021/4/2718,IFA结果判断,2021/4/27,19,IFA结果判断2021/4/2719,二、免疫层析测定（ ICA ）,2021/4/27,20,二、免疫层析测定（ ICA ）2021/4/2720,ICA 试剂条,样品垫,结合物垫,NC膜,吸水垫,2021/4/27,21,ICA 试剂条样结NC吸2021/4/2721,ICA双抗体夹心法测抗原,2021/4/27,22,ICA双抗体夹心法测抗原2021/4/2722,ICA间接法测抗体,2021/4/27,23,ICA间接法测抗体2021/4/2723,ICA 结果观察,阳性,阴性,无效,2021/4/27,24,IC

9、A 结果观察 阳性阴性无效2021/4/2724,IFA与ICA的比较,2021/4/27,25,IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试,IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 横流（LATERAL FLOW）,2021/4/27,26,IFA 2021/4/2726,GIFA技术的发展（间接法测抗体）,2021/4/27,27,GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测,GIFA技术的发展,2021/4/27,28,GIFA技术的发展第一代 HIVCHEK（DuPont,ICA技术的发展,1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unip

10、ath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.13 ng/ml 合成TnT质控点,2021/4/27,29,ICA技术的发展1990年 ABBOTT公司 胶体硒,S,C,TC2 C1,测定线,对照线,半定量测定,2021/4/27,30,IFAIFAICASCT测对半定量测定2021/4/2730,三、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA,2021/4/27,31,三、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA2021/4,四、酶联免疫斑点试验 ELISPOT,20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本

11、原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。,2021/4/27,32,四、酶联免疫斑点试验 ELISPOT20世纪80年代，,ELISPOT 检测原理,细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。,2021/

12、4/27,33,ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞,2021/4/27,34,2021/4/2734,ELISPOT 分析仪解决以下问题,哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） 斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？ 几次重复实验才能使结果更有意义？,2021/4/27,35,ELISPOT 分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性 T,ELISAPOT,202

13、1/4/27,36,ELISAPOT2021/4/2736,ELISPOT结果判断,2021/4/27,37,ELISPOT结果判断2021/4/2737,五、免疫印迹法Westernblot法,原理,Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检,2021/4/27,38,五、免疫印迹法Westernblot法原理Western,六、放射免疫沉淀试验,原理,放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏,2021/4/27,39,六、放射免疫沉淀试验原理放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏,小 结,固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA 、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。,2021/4/27,40,小 结 固相膜免疫测定与ELISA相,谢谢,谢谢,