十一章固相膜免疫测定课件.ppt

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1、第十一章固相膜免疫测定,第十一章固相膜免疫测定第十一章固相膜免疫测定4.ELISA双抗体夹心法是 ( ) A.酶标记特异抗体用于抗原的检测B.先将待测抗原包被于固相载体C.标记一种抗体可检测多种抗原D.能用于半抗原的测定E.属竞争结合测定5.捕获法主要用于何种物质的测定 A.IgM B.IgG C.IgA D.IgD ( )AA2021/4/272,第十一章固相膜免疫测定第十一章固相膜免疫测定第十一章固相膜免,4.ELISA双抗体夹心法是 ( ) A.酶标记特异抗体用于抗原的检测B.先将待测抗原包被于固相载体C.标记一种抗体可检测多种抗原D.能用于半抗原的测定E.属竞争结合测定5.捕获法主要用

2、于何种物质的测定 A.IgM B.IgG C.IgA D.IgD ( ),A,A,2021/4/27,2,4.ELISA双抗体夹心法是 ( )AA2021/4/2,6、下列哪种方法用一种标记物可检测多种被测物 ( ) A.ELISA双抗体夹心法 B.ELISA竞争法C.ELISA间接法 D.ELISA捕获法E.放射免疫测定法7.关于ELISA竟争法,正确的是 ( )A.用于检测抗原 B.被测物与酶标记物的免疫活性各不相同 C.被测物多则标记物被结合的机会少 D.待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少E.结合于固相的酶标抗原量与样品中被测抗原量成正比,C,C,2021/4/27,3,6、下列哪种

3、方法用一种标记物可检测多种被测物 ( )C,1.每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1 B.2 C.3 D.4 2.生物素分子中与亲和素结合的主要部位是 ( ) A.噻吩环 B.咪唑酮环 C.苯环 D.羰基 E.-NH-3.在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是A.HRP B.葡萄糖氧化酶 C.-Gal D.AP ( ),B,D,2021/4/27,4,1.每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1 B.2,第十一章,固相膜免疫分析技术,2021/4/27,5,第十一章固相膜免疫分析技术2021/4/275,掌握：免疫印迹试验熟悉：胶体金免疫技术的方法学种类与原理了解：胶体金与免疫金的制备、其他

4、膜载体免疫分析技术,2021/4/27,6,掌握：免疫印迹试验2021/4/276,一 概述二 免疫层析试验三 免疫渗滤试验四 斑点酶联免疫吸附试验五 免疫印迹试验六 影响固相膜免疫试验的主要因素七 固相膜免疫分析技术的临床应用,2021/4/27,7,一 概述2021/4/277,概述固相膜免疫分析技术 (solid phase membrane-based immunoassay)特点:以微孔膜作为固相载体 多孔性, 非共价键高度吸附抗原或抗体 易于漂洗,2021/4/27,8,概述2021/4/278,第二节 免疫层析试验,免疫层析试验原理： 以NC膜等为固相载体，样品溶液借助毛细作用在

5、层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过目测或仪器检测标记物，在短时间内得到直观的实验结果。,2021/4/27,9,第二节 免疫层析试验免疫层析试验原理：2021/4/27,毛细作用是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象,2021/4/27,10,毛细作用2021/4/2710,第二节 免疫层析试验,免疫层析试验分为：胶体金免疫层析试验（ICA）荧光免疫层析试验（GICA）,2021/4/27,11,第二节 免疫层析试验免疫层析试验分为：2021/4

6、/27,二、 测定模式（一）胶体金免疫层析试验,1、双抗体夹心法测抗原2、竞争法测小分子抗原3、间接法测抗体,2021/4/27,12,二、 测定模式（一）胶体金免疫层析试验1、,胶体金免疫层析试验,A,G,C,B,双抗体夹心法测大分子抗原（阳性，2个条带）,2021/4/27,13,胶体金免疫层析试验AGCB双抗体夹心法测大分子抗原2021/,胶体金免疫层析试验,A,G,C,B,竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带）,2021/4/27,14,胶体金免疫层析试验AGCB竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带,三 技术要点操作要点：（1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5s,或在标本加样处加一定

7、量待检标本,平放于水平桌面上（2）在5-20分钟内观察结果结果判断 夹心法：阴性:1条棕红色指控条带 阳性:出现2条棕红色条带 无棕红色条带出现为试剂失效竞争法：阴性:出现2条棕红色条带。阳性:1条棕红色指控条带,2021/4/27,15,三 技术要点2021/4/2715,第三节 免疫渗滤试验,1 原理在硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到检测目的。2 方法类型双抗体夹心法测抗原间接法测特异性抗体,2021/4/27,16,第三节 免疫渗滤试验1 原理202

8、1/4/2716,三、试剂盒组成和技术要点,渗滤装置胶体金标志物洗涤液Ag参照品,2021/4/27,17,三、试剂盒组成和技术要点 渗滤装置2021/4/2717,技术要点：,1、平放反应板，于小孔内滴加含待测Ag标本1-2滴，与膜上的Ab反应而结合在膜上2、于小孔内滴加胶体金标记Ab试剂1-2滴，使胶体金标记Ab与结合在膜上的Ag反应3、于小孔内滴加洗涤液2-3滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记Ab。4、结果观察： 阳性 膜中央有淡红色或红色斑点,2021/4/27,18,技术要点：1、平放反应板，于小孔内滴加含待测Ag标本1-2滴,第四节.斑点酶免疫吸附试验 (Dot-ELISA),

9、2021/4/27,19,第四节.斑点酶免疫吸附试验 (Dot-ELISA)2021/,技术要点：1、抗原包被 NC膜吸附力强，包被后封闭。2、抗原抗体反应 抗原抗体反应后再加二抗3、确定酶结合物最佳稀释度阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度4、显色反应 pH值5.8-6.0时反应最灵敏强阳性蓝黑色斑点 弱阳性淡绿色半点,2021/4/27,20,技术要点：2021/4/2720,方法学评价：1、NC吸附力强，灵敏度较ELISA高68倍；2、可同时检测多种抗体；3、操作简便不需特殊仪器设备4、吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存，不影响期活性。,2021/4/27,21,方法

10、学评价：2021/4/2721,第五节.免疫印迹试验 （immunoblot test ,IBT）,免疫印迹试验将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的高特异性结合.又称Western blot.是检测蛋白质特性、表达及分布的一种最常用的方法。蛋白免疫印迹试验重组免疫印迹试验,2021/4/27,22,第五节.免疫印迹试验 （immun,二 Western blot技术要点 :1.抗原印迹与包被（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）电转移 2.抗原抗体反应 （间接法）3.检测,动画,2021/4/27,23,二 Western blot技术要点 :动画2021/,SDS-PAGE 抗原等蛋白样品经SDS处

11、理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）,2021/4/27,24,SDS-PAGE2021/4/2724,2021/4/27,25,2021/4/2725,电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1-2A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。,2021/4/27,26,电转移2021/4/2726,2021/4/27,27,2021/4/2727,酶免疫定位 将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，

12、加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量。,2021/4/27,28,酶免疫定位2021/4/2728,免 疫 印 迹 法,2021/4/27,29,免 疫 印 迹 法 2021/4/2729,2021/4/27,30,2021/4/2730,（三）方法学评价：1、特异性强2、吸附蛋白能力强3、可同时检测多种抗体4、膜条的重复检测应用,2021/4/27,31,（三）方法学评价：2021/4/2731,第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素一 试剂方面二 标本方面三 实验过程第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用 激素、自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、过敏原和毒品。,2021/4/27,32,第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素2021/4/2732,谢谢,谢谢,