十一章免疫学的应用课件.ppt
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1、第十一章 免疫学的应用,第十一章 免疫学的应用第十一章 免疫学的应用,第十一章 免疫学的应用第十一章 免疫学的应用第十一章 免疫学,第一节免疫学检测,免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。,第一节免疫学检测免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检,基本概念抗原(antigen):指能在机体中引起特异性免疫应答反应,同时又能与免疫应答物(如抗体)产生特异性结合的物质。抗体(antibody):是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白。 抗原决定簇:是指抗原表面决定抗原特异性的某些特定化学结构,抗原以此与相应抗体结合,基本概念
2、,第十一章-免疫学的应用课件,药物分子的抗原性 蛋白、多肽、激素类药物具有免疫原性及抗原特异性。 小分子药物无免疫原性,但具抗原特异性,称为为半抗原。,药物分子的抗原性,抗原抗体反应的特点特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性,抗原抗体反应的特点,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体,(1)检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病: 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。(2)检测自身抗体诊断自身免疫病:SLE、类风湿性关节炎等,2、利用已知抗体检测未知抗原,(1)鉴定病原菌:诊断疾病(2)检测肿瘤相关抗原:检测甲胎蛋白以诊断肝癌(3)检测血型抗原、HLA抗原:鉴定血型,亲子鉴定(4)
3、检测药物半抗原: 确认运动员是否服用兴奋剂,应 用1、利用已知抗原检测未知抗体(1)检测病原微生物,抗原或抗体的检测方法,凝集反应沉淀反应免疫标记技术,抗原或抗体的检测方法 凝集反应,(一)凝集反应(agglutination),颗粒性抗原(红细胞、细菌等)与抗体特异性结合,形成肉眼可见的凝集块。,1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集,细菌的鉴定和血型的检查,一、 传统免疫分析,(一)凝集反应(agglutination) 颗,2、间接凝集(indirect agglutination) 可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面,与相应 抗体混合出现的凝集
4、现象。,检测病原体可溶性抗原,病原体感染后产生的抗体,2、间接凝集(indirect agglutination),(二)沉淀反应(precipitation),可溶性抗原(免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等)与相应抗体结合, 形成不溶性免疫复合物,出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行,形成白色的沉淀。,免疫比浊法,(二)沉淀反应(precipitation),1、单向免疫扩散(single immunodiffusion):可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散,为一种半定量试验。,环的直径与抗原含量成正相关,1、单向免疫扩散(single immunodiffusio,2、双
5、向免疫扩散(doule immunodiffusion):抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。,一致,部分一致,不一致,有多种成分,2、双向免疫扩散(doule immunodiffusion,3、免疫电泳(immunoelectrophoresis),常用于血清蛋白种类分析,以观察Ig的异常增多或缺失。,1)简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离,可将蛋白质抗原分子分成不同的区带,然后将抗血清加入琼脂板横槽中,使二者进行双向扩散,当比例合适时即形成特异性的沉淀线,,3、免疫电泳(immunoelectropho
6、resis)常,2)对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术,2)对流免疫电泳(counter immunoelectro,3)火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis),抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶,并于抗体发生反应,形成沉淀带。可定量分析。,3)火箭免疫电泳(rocket immunoelectro,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 :异硫氰酸荧光素(黄绿色荧光)、藻红蛋白、 罗丹明(红色荧光),放射性同位素: 125I、1
7、31I,酶:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法(IFA),放射免疫检测法(RIA),酶免疫检测法(EIA),二、现代免疫分析-免疫标记技术,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提,1抗体制备。多克隆抗体单克隆抗体,2标记物与标记方法。 放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。,免疫分析基本环节,1抗体制备。免疫分析基本环节,3分析方式设计:非竞争方式、竞争方式;直接法、间接法;标记抗原、标记抗体;均相、非均相4.信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。,3分析方式设计:非竞争方式、竞争方式;直接法、间接法;,(一)、放射免疫分析 (Ra
8、dioimmunoassay RIA) 利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。特点: 灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测,(一)、放射免疫分析 (Radioi,1.放射免疫分析必需的基本试剂:抗体:作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。标记药物:提供可检测的信号(响应值)(放射性、光吸收、荧光发射)。非标记药物:在标准曲线制备时是药物标准品,(在样品中则为被测药物)分离剂分离结合与游离部分,1.放射免疫分析必需的基本试剂:,结合相,游离相,2.基本原理:RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。,结合相游离相2.
9、基本原理:RIA是标记抗原和未标记抗原对有限,标记药物(S*)+抗体(Ab) 标记药物-抗体复合物(S*-Ab) F* P-B* B* F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度,它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。,第十一章-免疫学的应用课件,非标记药物(S) F +标记药物(S*)+抗体(Ab) 标记药物-抗体复合物(S*-Ab) F* P-B-B* B* 非标记药物-抗体复合物(S-Ab) B随着S的加入,它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用,表现为使B*减少、使F*增加,并且只要S加入一定量,便有对应的F*和B*信号强度值,因此可建立S量
10、(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系,作成剂量反应曲线。,非标记药物(S),免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图,免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图,第十一章-免疫学的应用课件,3.标准曲线的绘制与样品测定步骤,取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成58个系列浓度。加入定量标记抗原,其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。加入定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求。将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反应平衡后测定总计数率(T)。,3.标准曲线的绘制与样品测定步骤取标准抗原,用无放射活性的空,加入分离剂,使结合部分(B)
11、与游离部分(F)分离。测定各管结合部分或游离部分的计数率。标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标,以结合率(B)为纵坐标作图。 纵坐标B的计算:将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较,即B=(BT)100;,加入分离剂,使结合部分(B)与游离部分(F)分离。,第十一章-免疫学的应用课件,例:125IRIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度,待测血清样品50l样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50l标准曲线各管中;50l 空白人血清零标准管.各管中依次加入保温液100l抗体溶液100l125I标记的地高辛(溶液)100l摇匀在室温(1
12、525)放置30min-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)在电磁搅拌(或手摇)下,迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内),摇匀离心10min(3000r/min)倾去上清液-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。,例:125IRIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度,(二)酶免疫分析(enzyme immunoassay) 标记物为酶,酶本身并不能直接产生信号,必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应,从而引起吸收光谱等的变化供测定。 常用的酶为: 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄
13、糖脱氢酶、溶菌酶、-半乳糖苷酶。,(二)酶免疫分析(enzyme immunoassay),酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲,1. 均相酶免疫分析,EMIT法(enzyme multipled immunoassay technique) 基本原理:酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab),测定小分子抗原。 酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后,所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgEAb)可使酶的活性发生改变(增强或减弱); 可直接通过测定酶活性的变化,求出样品含量的方法。,1. 均相酶免疫分析,EMIT法(enzyme multip,第十一章-免疫学的应用课
14、件,2.酶联吸附免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)属于非均相免疫分析的代表,普遍应用于各领域。基本原理:是将过量抗体(抗原)包被于载体上,通过抗原抗体反应使酶标记抗体(抗原)也结合在载体上,经洗涤去除游离的酶标记抗体(抗原)后,加入底物显色,定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。,2.酶联吸附免疫分析(enzyme-linked immun,3种必要的试剂:固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)酶标记的抗原或抗体(标记物)酶作用的底物(显色剂),3种必要的试剂:,第十一章-免疫学的应用课件,1)双抗体夹心法方法:用已知抗体包被,
15、加入待检样品,再加酶标抗体,加底物显色应用: 二价或二价以上的较大分子抗原测定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,1)双抗体夹心法,第十一章-免疫学的应用课件,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本(抗原)形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的 酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未
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