【发酵工程】余龙江版第11章 发酵产物的分离纯化ppt课件.ppt
《【发酵工程】余龙江版第11章 发酵产物的分离纯化ppt课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《【发酵工程】余龙江版第11章 发酵产物的分离纯化ppt课件.ppt(202页珍藏版)》请在三一办公上搜索。
1、第11章 发酵产物的提取与精制,发酵产物的提取与精制属于发酵工程的下游加工技术。下游加工亦称发酵后处理,是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。在多数情况下是从稀的发酵液中回收目的产物,整个过程有多项单元操作组成,其中有许多是经典的化工单元操作。,11.1 下游加工过程概述,一、下游加工过程的重要性,1. 获得商业产品的关键环节。,2. 促进发酵工程上游加工技术 或工艺的改进。,3. 拥有市场竞争力的重要保证。,二、下游加工过程的特点,2. 发酵产品在培养液中具有浓度低,稳定性差,对酸碱等外界环境十分敏感,容易失活。3. 下游加工过程代价昂贵,产品回收率不是很高。4. 发酵过
2、程复杂,要求下游加工工艺应具有相当的适应性,以确保最终产品的纯度和质量。,1. 发酵液是复杂的多相系统,属非牛顿液体,从中分离所需产品困难大。,三、下游加工的原则和要求,原则: 1)短时间内处理 2)分离时尽量低温 3)选择生物物质稳定的pH 4)要程序化进行清洗,消毒,包括厂房,设备,管路要求: 1)达到所需的纯度 2)成本要低,得率高 3)工艺过程要简便,对分离物质特性清楚 4)废弃物要易处理,能够做到综合利用(零排放;清洁生产) 5)实验室产品能够放大生产,四、下游加工工程的一般流程,1. 粗分离阶段(1)发酵液的预处理和固-液分离。(2)产物的初分离。2.纯化精制阶段(3)1产物的高度
3、纯化。(4)成品加工。,预处理,破碎细胞,碎片分离,细胞分离,精制,成品加工,F发酵液,提取,加热 沉降 均化 离心分离 沉淀 层析 无菌过滤 调pH 离心分离 研磨 萃取 吸附 离子交换 浓缩 絮凝 过滤 溶胞 超滤 萃取 亲和 超滤 膜分离 双水相萃取 超滤 憎水 冷冻干燥 吸附 喷雾干燥 电泳 结晶,发酵液,胞外产物,操作步骤减至最少,并尽可能提高各步骤的收率,一、发酵液的一般特征 1. 含水量高,一般可达9099%,处理体积大。 2. 产品浓度低。 3. 悬浮物颗粒小,密度与液体相差不大。 4. 固体粒子可压缩性大,一压缩就变形。 5. 液体黏度大,大多为非牛顿型流体。易吸附在滤布上。
4、 6. 产物性质不稳定,不耐热、等会酸碱敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。,11.2 发酵液的预处理与固-液分离,二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的 (1)改变发酵液的物理性质,促进悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离器的效率 (2)尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数是液体) (3)去除发酵液中部分杂质,以利于后续各步操作。,2.发酵液预处理的要求: (1)菌体的分离 (2)固体悬浮物的去除 (3)蛋白质的去除 (4)重金属离子的去除 (5)色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 (6)改变发酵液的性质 (7)调节适宜pH值和温度,三、发酵液预处理的方法,1. 降低液
5、体的黏度2. 絮凝法3. 重力法4. 等电点法5. 加入助滤剂6. 缴入反应剂,1 降低液体黏度,(1) 加水稀释法 采用加水稀释法虽然能降低液体黏度,但是会增加发酵液的体积,因此加大后续过程的处理量。 而且稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才算真正有效,即若加水一倍,则稀释后液体的黏度必须下降50%以上,才能有效提高过滤效率。,(2)加热法,升高温度可以降低悬浮液的黏度,除去某些杂蛋白,降低悬浮物的最终体积,破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度,提高过滤效率。 不适用热敏性的物质,而且要防止加热导致细胞溶解,胞内物质外溢。,(3)添加酶制剂,比如:加酶将多糖转化为单糖,凝聚是在高价无机盐作
6、用下,由于双电层排斥电位的降低,而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团的过程,是一种以物理的集合为主的过程。,凝聚和絮凝的概念,扩散双电层的结构模型图胶粒能保持分散状态的原因,2. 凝聚和絮凝法,凝聚技术,扩散双电层的结构模型图,凝聚原理:电解质将胶体粒子表面上的电荷中和,减少存在于胶体粒子间的静电斥力,使范德华力占优势,这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子。,胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构,一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时,即产生使两个粒子分开:从而阻止了粒子的聚集。电位越大,电
7、排斥作用就越强,胶粒的分散程度也越大, 此外,由于胶粒表面的水化作用,形成了包围于粒子周围的水化层,也能阻碍胶粒间的直接聚集。 但是,水化膜主要是伴随胶粒带电而引起的,一旦电位降低或消除,水化层也会随之减弱或消失。,常用的凝聚剂Al2(SO4)3.18H2O,AlCl3.6H2O,FeCl3,ZnSO4,MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为:Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+,常用的凝聚方法:在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。,絮凝原理:在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。,絮凝剂
8、通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上,产生桥架连接时,就形成了较大的絮团,这就是絮凝作用。,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,其相对分子质量可高达数万至一千万以上,长链状结构,其链节上含有许多活性官能团,包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如-NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。,常用的絮凝剂:明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠,+,- -,影响絮凝的因素,絮凝剂的添加量发酵液的pH絮凝剂的分子量搅拌转速搅拌时间,混凝有时候絮凝剂是高分子非离子型和阴离子型的,主要通过分子间引
9、力或氢键作用产生吸附架桥,因此通常与无机凝聚电解质搭配使用。首先加入电解质,使悬浮粒子间的双电子层电位降低、脱稳,凝聚成微粒,然后再加入絮凝剂凝聚成较大的颗粒。,3. 重力法,在工业上用的较多的主要是离心和过滤. 过滤常用板框真空吸滤或电动筛等,离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。,一般温度高,压力大,发酵液粘度小,滤布选用适当,助溶剂适宜,搅拌都可以提高过滤速度。,4、等电点法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。蛋白质在某一pH下,净电荷为零,溶解度最小,称为等电点。因此可利用此特性分离或去除良性物质。因为羧基的电离度比氨基大,故蛋白质的酸性性质通常强于
10、碱性,因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH 4.05.5)。,5、添加助滤剂: 一般为惰性助滤剂:是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质 作用:助滤剂表面具有吸附胶体的能力,并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构,不可压缩,滤孔不会被全部堵塞,可以保持良好的渗透性 使用方法(1):在滤布上预涂,作为过滤介质使用 (2):按一定比例混入待滤的悬浮液中 常用的助滤剂:硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙,6、添加反应剂: 添加可溶解的盐类,生成不溶解的沉淀; 生成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构; 沉淀本身可作为助滤剂,还能使胶状物和悬浮物凝固。
11、,四、发酵液的相对纯化,1.高价无机离子的去除(Ca2+、Mg2+、Fe2+等)2.可溶性杂蛋白的去除,高价无机离子的存在,会影响树脂对生化物质的交换容量。杂蛋白质的存在,不仅在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力,而且在采用有机溶剂或两水相萃取时,容易产生乳化,使两相分离不清,在预处理时,应尽量除去这些物质。,1 高价无机离子的去除,发酵液中杂质很多,其中对提炼影响最大的是高价无机离子(Ca2、Mg2、Fe2)等。,去除钙离子:通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小,不适合用量较大的场合,可用其可溶性盐,草酸价格昂贵,注意回收。去除镁离子:加入三聚磷酸钠,与镁离子形成络合物。用
12、磷酸盐处理,也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如:环丝氨酸的提取。去除铁离子:可加入黄血盐,使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。,2. 杂蛋白质的除去(1)沉淀法 加热变性 蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过程称为变性。使蛋白质变性的方法有:加热,调节pH,加酒精等有机溶剂或表面活性剂等 。 在链霉素生产中,在pH3.0时,加热至7075,维持30min,黏度降为1/6,过滤速度提高3倍。,变性法的局限性:加热法只适合于对热较稳定的目的产物;极端pH也会导致某些目的产物失活,并且要消耗大量酸碱;而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。, 加有机溶剂、表面活性剂、酸碱等 在酸性溶液中,蛋
13、白质能与一些阴离子,如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀; 在碱性溶液中,蛋白质能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。,(2)吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如:在枯草芽孢杆菌发酵液中,加入氯化钙和磷酸氢二钠,两者生成庞大的凝胶,把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,从而可加快过滤速率。,11.3 固-液分离过程及设备简介,意义:固-液分离过程下游加工的重要环节,用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。,方法:常用的方法有过滤、离心。此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。,
14、影响发酵液固-液分离的主要因素:菌体的大小、形状及发酵液的黏度,还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。,目的:收集胞内产物的细胞或菌体,分离除去液相,或者是收集含生化物质的液相,分离除去固体悬浮物,如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,1. 过滤,定义:用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。,常用的过滤方式:加压过滤和真空过滤,典型设备主要有:板框压滤机和鼓式真空过滤机,(1)板框过滤机,板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。,真空转鼓过滤机,优点: 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大(
15、10)的悬浮液的分离,在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点: 由于受真空度的限制,不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤,且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,2、离心,定义: 基于固体颗粒和周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,离心分离方法,(1)差速离心工业上最常用的离心分离方法,定义:在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。对象:混合样品中各沉降系数差别较大的组分。,速度逐渐提高,样品按大小先后沉淀,原理:用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质
16、的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。分类:1)移动区带离心 2)等密度离心常用密度梯度物质:蔗糖、甘油、CsCl、NaBr,(2)密度梯度离心多用于生化研究,1)移动区带离心,含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时,每种颗粒都达到其最大沉降速度,这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液,并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面,界面的移动相对于每种组分来说是特征的。 用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。此法所采用的介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,2)等密度离心,细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身
17、密度相等的介质处,并停留在该层达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,离心机分类,制备性离心机,分析性离心机:超速离心机,普通离心机,高速冷冻离心机,超速离心机,实验型离心机,工业型离心机,碟片式离心机是传统离心机,为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000,最大处理量达到300m3/h,常用于大规模的分离过程。适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片。,管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备,其转鼓细长,可在15000-50000的高转速下工作,分离因数可达104-6105。它设备简单、操作稳定。适用范围细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。
18、,影响固液分离的因素,微生物种类真菌的菌体大,固液分离容易,可采用真空转鼓式过滤或板框过滤;细菌和细胞碎片小,固液分离较难,固液分离前要进行预处理。发酵液黏度固液分离速度与黏度成反比。其它因素培养基组成、发酵周期、发酵液的pH值、温度和加热时间等,离心分离 (1)优点: 分离速度快,效率高, 操作时卫生条件好等优点, 适合于大规模的分离过程。 (2)缺点: 投资费用高, 能耗较大。,3. 其他固-液分离方法,(1)膜分离:利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以 分离的方法,(2)双水相萃取:利用不同组分在双水相分配系数不同进 行分离方法。,(3)扩张床吸附:将固-液分离合目的产物吸附合并成一步
19、 进行的一种分离方法。,11.4 微生物细胞的破碎,微生物的代谢产物如果是胞内物质(如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等),那么首先要收集菌体,进行细胞破碎。,1. 微生物细胞壁的组成与结构:(1)细菌细胞壁:(2)酵母菌细胞壁比G+菌稍厚,主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。(3)其他真菌细胞壁主要由多糖组成,如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。,2. 常用的细胞破碎方法,细胞破碎的方法很多,根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。亦可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。物理破碎法:高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法;化学破碎法:渗透冲击法、增溶法。生物破碎法:酶溶
20、法,细胞破碎机理图,(1)物理破碎法, 高压匀浆法 大规模细胞破碎的常用方法,原理:利用高压使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。,适用范围:适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。特点:在操作方式上,可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式,也可连续操作。,大、中、小型高压匀浆器, 挤压法(X-press法),将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25至-30形成冰晶体,利用500 MPa以上的高压冲击,冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。,原理:细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变,包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。,优点:适用
21、的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。缺点:对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。, 高速珠磨法,原理:进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂(直径小于1mm)一起快速搅拌或研磨,研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞,使细胞破碎,释放出内含物。,优点:可连续操作,缺点:破碎中产生的热量,需采用冷却措施。,胶体磨,德国进口珠磨机, 超声波破碎法,超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15-25千赫(kHz)的频率下操作。,原理:在超声波作用下液体发生空化作用,空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波,将声能转化为机械能,形成
22、粘性消散涡流,如果液体旋涡小于细胞尺寸,产生不同密度移动,当细胞的动能超过细胞壁强度时,至使细胞破碎。,特点:杆菌比球菌易破碎,革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎,酵母茵效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高,均不利于超声波破碎。,最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大量热量,不能及时将热量移出,细胞悬浮液的温度急剧升高,导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此,在实验室中往往采取间断破碎的方法,即经短时间破碎,冷却降温,再进行破碎,经多次反复达到破碎目的。 因此在细胞破碎过程中,有效冷却是关键。 也因大容量容器的声波传递和散热困难,限制了超声破碎的大规模应用。,球蘑机的粉碎球和机器,匀浆机,
23、组织粉碎机,(2)化学破碎法,定义:利用化学试剂改变细胞壁或膜的结构或完全破除细胞壁形成原生质体后,在渗透压作用下使从而使细胞膜破裂而释放胞内物质的方法。,优点:对产物的释出选择性好,细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少,便于后步分离等优点,故使用较多。缺点:容易引起活性物质失活破坏;化学试剂的加入,常会给随后产物的纯化带来困难,并影响最终产物纯度。,特点:较温和的一种破碎方法,操作也简单。应用:仅对细胞壁较脆弱的菌,或者细胞壁预先用酶处理,或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。, 渗透压冲击,原理:将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),达到平衡后,转入到渗透压低的缓
24、冲液或纯水中,介质被突然稀释,或者将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,水迅速进入细胞内,引起细胞壁的破裂。,如:将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤,除去细胞沾染的培养基或其它杂质,将其悬浮在含10-30%蔗糖的适当缓冲液中,为了防止目的酶或蛋白质失活,若目的酶或蛋白质需要金属离子时,在缓冲液中加入金属离子;若金属离子会使目的酶或蛋白质失活,在缓冲液中需加入金属离子螯合剂,如EDTA等。在低温下,使细胞悬浮液混合均匀,放置使细胞内外渗透压达到平衡。在低温下离心,收集细胞;在激烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度的缓冲液中,由于细胞外渗透压突然降低,使细胞破碎。,应用,用此法
25、处理大肠杆菌,可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般仅占细胞蛋白质的4-7%。因此,后序的蛋白质分离纯化比较简单。此法对细胞壁外有着牢固的糖蛋白包裹层,使胞内渗透压不受严重影响的格兰氏阳性菌不适用。在高渗透压环境下生长的细菌, 如海洋细菌,嗜盐细菌,更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶释放,酶释放率可达到80-90%。,原理:利用某些化学试剂如有表面活性剂等,增加细胞壁或膜的通透性,而使细胞破碎的方法。, 增溶法:,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,常用的表面活性剂有SDS、EDTA、Triton X-100,有机溶剂有
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 发酵工程 【发酵工程】余龙江版第11章 发酵产物的分离纯化ppt课件 发酵 工程 龙江 11 产物 分离 纯化 ppt 课件
链接地址:https://www.31ppt.com/p-1308684.html