五章节生物技术原理.ppt

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1、五章节生物技术原理,五章节生物技术原理,21世纪是生命科学与生物技术的世纪，生物技术被世界各国视为一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。,21世纪是生命科学与生物技术的世纪，生物技术被世界各国视为一,生物技术也称为生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合其它基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，改造或重新设计细胞的遗传物质，按照预先的设计改造生物体，获得优良品质的动物、植物和微生物品系，或加工生物原料，为人类生产出所需产品，达到提高社会生产力和生活质量的目的。,基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程,生物技术,传统生物技

2、术:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶现代生物技术:20,第一节 基因工程操作原理第二节 细胞工程操作原理第三节 酶工程第四节 发酵工程第五节 蛋白质工程第六节 分子杂交与遗传标记,生物技术的发展日新月异，新成果层出不穷，了解生物技术原理有利于理解和利用生物技术为社会服务。,旨在通过本章的学习，达到了解生物技术基本原理的目的。,第一节 基因工程操作原理 生物技术的发展日新月异，新,第一节 基因工程操作原理（P133）,一、什么是基因工程二、基因工程操作技术及原理,第一节 基因工程操作原理（P133）一、什么是基因工程,一、什么是基因工程,概念：也叫 基因操作 遗传工程 重组DNA技术,基因工程主要原

3、理,基因工程四个步骤,用人工方法，把生物的遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表 达的技术。,克隆目的基因，取得所需要的DNA特异片段。与DNA载体连接成重组DNA。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。,第一节 基因工程操作原理,一、什么是基因工程 概念：也叫 基因操作基因工程主要原理,（一）核酸分子的提取技术（二）电泳技术（三）各种酶的使用（四）基因克隆（五）体外重组（六）载体构建（七）转化（八）重组体的筛选与鉴定（九）培育新型品种,二、基因工程操作技术及原理,第一节 基因工程操作原理,（一）核酸分子的提取技术二、基因工程操作技术及

4、原理第一节 基,分类：,方法：,（一）核酸分子的提取技术,RNA的提取总DNA的提取质粒DNA的提取,首先，粉碎组织细胞；其次，DNA用乙醇等进行沉淀；最后，用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。,第一节 基因工程操作原理,分类：方法：（一）核酸分子的提取技术RNA的提取首先，粉碎组,（二）电泳技术,带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种生物大分子在一定pH值条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。,分类：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。,概念：,第一节 基因工程操作原理,（二）电泳技术带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。,总RNA,总DN

5、A,质粒DNA,第一节 基因工程操作原理,总RNA总DNA质粒DNA第一节 基因工程操作原理,第一节 基因工程操作原理,（三）各种酶的使用,1、限制性内切酶的使用,分类：型酶、型酶和型酶。,概念：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,第一节 基因工程操作原理 （三）各种酶的使用1、限制性内切酶,用质粒构建,第一节 基因工程操作原理,重组DNA分子,用质粒构建第一节 基因工程操作原理 重组DNA分子,用噬菌体DNA构建,第一节 基因工程操作原理,重组DNA分子,用噬菌体DN

6、A构建第一节 基因工程操作原理 重组DNA分子,限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建,第一节 基因工程操作原理,限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建第一节,2、DNA连接酶的使用,DNA连接酶能够催化具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段之间形成磷酸二酯键。在基因克隆中用来连接载体与目的基因。,第一节 基因工程操作原理,2、DNA连接酶的使用DNA连接酶能够催化具有3-OH基团,DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。

7、,3、DNA聚合酶的使用,第一节 基因工程操作原理,DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3-,4、逆转录酶的使用,逆转录酶可以RNA为模板合成DNA，即cDNA（互补DNA）。在基因克隆中常用来构建cDNA文库。,第一节 基因工程操作原理,4、逆转录酶的使用逆转录酶可以RNA为模板合成DNA，即cD,（四）基因克隆,第一节 基因工程操作原理,（四）基因克隆第一节 基因工程操作原理,5,3,3,5,5,3,3,5,+,变性(94),复性(55),5,3,P1,3,5,+,P2,+,P1,P2,合成（72）,PCR,一般用PCR 扩增方法，根据已知基因的序列设计引物来克隆基因。,

8、1、克隆已知基因序列的基因,第一节 基因工程操作原理,53355 33 5+变性(94)复性(5,第一节 基因工程操作原理,在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建cDNA 文库或基因组文库，然后以该基因（或部分序列）为探针来筛选目的基因的克隆。,第一节 基因工程操作原理 在某种植物的同源基因被克隆的条件下,作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。克隆植物分子连锁图谱定位的基因，可采用作图克隆的策略。作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆（BAC或YAC库）的染色体步移到达靶基因。,第一节 基因工程操作原理,3、作图克隆,根据基

9、因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行PCR扩增。,2、功能克隆,作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术,第一节 基因工程操作原理,（1）消减杂交法（2）DNA 标签法（3）差别显示技术包括：mRNA 差别显示法等。 （4）缺陷互补和反义mRNA技术（5）cDNA微阵列和基因芯片技术,4、 表型差异克隆,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。,第一节 基

10、因工程操作原理 （1）消减杂交法4、 表型差异克隆,利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。,5、染色体大片段基因克隆,第一节 基因工程操作原理,利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因,第一节 基因工程操作原理,是将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA 分子。,（五）体外重组,第一节 基因工程操作原理 是将带有目的基因的,理想的运载体是质粒，当给它安装一段外来 DNA片段后，它依然如故地进行自我复制。,（六）载体构建,第一节 基因工程操作原理,理

11、想的运载体是质粒，当给它安装一段外来 DNA片段后,（1）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵培养。,（七）转化,1、植物转基因技术,第一节 基因工程操作原理,（1）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转,又称微弹轰击法。其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化，,（2）基因枪法,第一节 基因工程操作原理,又称微弹轰击法。其基本原理是将外源D

12、NA包被在微小的金粒或钨,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。,（3）花粉管通道法,第一节 基因工程操作原理,80年代初期周光宇转基因抗虫棉不依赖组织培养,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源D,首先制备植物原生质体，游离出细胞，在倒置显微镜和显微操作器的帮助下，将目的基因DNA通过微管注射到受体细胞中。,（4）微注射法,第一节 基因工程操作原理,首先制备植物原生质体，游离出细胞，在倒置显微,在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的直径

13、为34 nm的小孔，但对原生质体生活力影响不大。这时，存在于原生质体周围溶液中的外源DNA，就可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。,（5）电穿孔法,第一节 基因工程操作原理,原生质体在短时间的微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约0.25 m2左右的小孔，使DNA分子进入细胞。,（6）微束激光打孔法,在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分,世界上主要有4类已报道的方法：1）融合法，包括精子融介法，微细胞介导融合等。2）化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法。3）物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等。4）病毒感染法，包括重组DNA

14、病毒感染、重组RNA病毒感染等。真正成熟方法显微注射DNA法精子介导法核移植法,2、转基因动物技术,第一节 基因工程操作原理,世界上主要有4类已报道的方法：2、转基因动物技术第,核显微注射法是转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内， 注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育， 这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA 片段。,（1）核显微注射法,第一节 基因工程操作原理,缺点：效率低表达结果的不确定性动物利用率低等,在反刍动物：繁殖周期长，较强的时间限制、需要大量的受体动物。,核显微注射法是转基因技术中最常用的方法

15、。它是在显微镜下将外源,精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给母畜授精。优点：成本很低，只有显微注射法成本的110。由于它不涉及对动物进行手术处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行试验。,（2）精子介导的基因转移,第一节 基因工程操作原理,精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因,先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。,（3）核移植转基因法,第一节 基因工程操作原理

16、,先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源,遗传检测法物理检测法菌落或噬菌斑杂交筛选法免疫化学检测法DNA 蛋白质筛选法转译筛选法等,（八）重组体的筛选与鉴定,技术方法:,第一节 基因工程操作原理,遗传检测法（八）重组体的筛选与鉴定技术方法:第一节 基因工程,草甘磷是一种广谱除草剂，将含有抗草甘磷的EP2SP合成酶突变基因引入植物，就可使植物获得抗除草剂特性，使大田作物便于除草，农业操作简便。,（九）培育新型品种,第一节 基因工程操作原理,草甘磷是一种广谱除草剂，将含有抗草甘磷的EP2SP合成酶突,在食品工业方面可提高微生物菌种性能，通过基因工程改造的面包酵母中麦芽糖透性酶和麦芽糖酶的含量

17、比普通面包酵母高，产生二氧化碳气体的量也较高，可制作出更松软可口的面包。,第一节 基因工程操作原理,在食品工业方面可提高微生物菌种性能，通过基因工程改造的面包, 凝乳酶传统方法是从小牛胃中提取，成本高，产量低，20 世纪80 年代以来，将凝乳酶原基因导入大肠杆菌，成功地进行了大规模的生产。,第一节 基因工程操作原理, 凝乳酶传统方法是从小牛胃中提取，成本高，产量低，20 世, 美国基因重组的抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。,目前，基因工程作物主要有玉米、大豆、水稻、棉花、马铃薯、番茄、烟草等。,第一节 基因工程操作原理, 美国基因重组的抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。 目前，,第一节 基因工程操作原理

18、,第一节 基因工程操作原理,“多莉”轰动了世界；“克隆人”让人匪夷所思；将人类的干细胞加到动物的早期发育胚胎中，导致猪体内流人血，老鼠长着人类脑细胞，小鼠背上长人耳。,第二节 细胞工程操作原理（P139）,一、什么是细胞工程二、细胞工程技术与原理,“多莉”轰动了世界；“克隆人”让人匪夷所思；将人类的干细胞加,细胞工程：按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，细胞融合，核质移植，染色体移植以及组织和细胞培养等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。,一、什么是细胞工程,第二节 细胞工程操作原理,细胞工程：按照人们

19、的需要和科学设计改变细胞的遗传基础，并通过,（一）细胞融合技术细胞融合，又称细胞杂交：是指在离体条件下用人工方法使两个或两个以上的细胞相互接触后，导致细胞合并形成一个新细胞的过程。,二、细胞工程技术与原理,第二节 细胞工程操作原理,自然融合人工诱导融合,通常所说的细胞融合指人工诱导融合。,（一）细胞融合技术二、细胞工程技术与原理第二节 细胞工程操,1、制备原生质体2、诱导细胞融合 3、筛选杂合细胞,细胞融合技术主要步骤:,第二节 细胞工程操作原理,1、制备原生质体细胞融合技术主要步骤:第二节 细胞工程操作,克隆技术：从同一个亲代细胞形成的一组细胞，形成大量子细胞的无性繁殖过程，这些子细胞和亲代

20、细胞完全相同， 多莉的诞生意味着人类可以利用动物的一个组织细胞“复印” 出大量相同的生命体，这个过程称为克隆技术。,（二）克隆技术,第二节 细胞工程操作原理,克隆技术：从同一个亲代细胞形成的一组细胞，形成大量子细胞的无,生物克隆原理,第二节 细胞工程操作原理,生物克隆原理第二节 细胞工程操作原理,染色体工程是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。 例如，向小麦中添加黑麦染色体形成小黑麦附加系、代换系等，为染色体的研究和育种提供新材料。,（三）染色体工程,第二节 细胞工程操作原理,染色体工程是按照预先的设计，添加、消除或替

21、代同种或异,将动物的一个早期胚胎如8细胞胚取出并在动物体外进行分割后，把分割胚胎都移植到母体内，结果得到由多个胚胎细胞克隆而成的生物。,（五）胚胎分割和移植技术,第二节 细胞工程操作原理,细胞质工程又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，细胞质的置换重建成新细胞。,（四）细胞质工程,将动物的一个早期胚胎如8细胞胚取出并在动物体外进行分,细胞核转移技术就是将一个细胞的细胞核取出，移入另外一个除去了细胞核的细胞中，组成一个完整的细胞。 该技术是体细胞克隆技术的基础。,（六）细胞核转移技术,第二节 细胞工程操作原理,细胞核转移技术就是将一个细胞的细

22、胞核取出，移入另外一,（七）干细胞工程,第二节 细胞工程操作原理,干细胞工程是利用干细胞的增殖特性，多分化潜能及其增殖分化的高度有序性，通过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化或利用转基因技术处理干细胞以改变其特性的方法。,（七）干细胞工程第二节 细胞工程操作原理 干,（八）大规模细胞组织培养技术,第二节 细胞工程操作原理,（八）大规模细胞第二节 细胞工程操作原理,第二节 细胞工程操作原理,第二节 细胞工程操作原理,第二节 细胞工程操作原理,第二节 细胞工程操作原理,生物体机器酶复杂高效化学反应。胃分泌的胃蛋白酶胰脏分泌的淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶,第三节 酶工程（P142）,一、酶工程的概念和内

23、容二、酶分析技术三、酶的生产四、酶的提取和分离纯化五、酶的固定化方法六、酶的应用,生物体机器酶复杂高效化学反应。第三节 酶工程（P,酶是一种在生物体内具有新陈代谢催化剂作用的蛋白质。具有反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低和反应易控制等特点。酶工程又称酶工艺学，就是利用酶的催化作用，利用酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等，通过工程学的手段，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。,一、酶工程的概念和内容,第三节 酶工程,酶是一种在生物体内具有新陈代谢催化剂作用的蛋白质。具有反应效,酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业、医药工业和临床诊断等方面。,对传统化学工业的改造

24、和“三废”处理等具有很大潜力。,第三节 酶工程,酶工程的应用主要集中于食品工业、,酶的工作效率很高， -淀粉酶在60 15分钟可使两吨淀粉转化为糊精，若用酸水解须在14O15O高温耐酸设备中至少进行2小时。目前，人们把酶工程分为生物酶工程和化学酶工程。,第三节 酶工程,酶的工作效率很高，第三节 酶工程,主要任务是：(1)采用基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。目前已成功地生产了 lOO多种酶。(2)通过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶(突变酶)。(3)设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。虽然生物酶工程技术的发展尚处在幼年时代，但它将开创从分子水平

25、根据遗传设计蓝图，创造出超自然生物机器的新时代。,1、生物酶工程,第三节 酶工程,主要任务是：1、生物酶工,2、化学酶工程(1)自然酶，是指由生物材料中分离出来的酶。(2)化学修饰酶又称“生物分子工程” ，是通过对酶分子实行“手术”以达到改构和改性的目的。(3)固定化酶，是将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶的作用。具有能反复使用、产物易纯化、可用微电脑控制，实行自动化连续化生产等优点。(4)人工合成酶，模拟酶的催化功能，用化学方法合成具有专一性的催化剂。,第三节 酶工程,2、化学酶工程第三节 酶工程,包括酶试剂盒、酶联免疫、酶标基因探针、酶传感器等等，已经在

26、临床诊断、生物工艺过程分析与监控、环境监测、检疫、生命科学研究等方面逐渐取代传统的化学分析法。,二、酶分析技术,第三节 酶工程,酶在分析生物技术领域应用也很广。,包括酶试剂盒、酶联免疫、酶标基因探针、酶传感,提取法、发酵法和化学合成法1、提取法：直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来。2、发酵法： 通过微生物发酵来获得人们所需要的酶。3、化学合成法：采用化学合成的方法获得酶。但是，成本比较高，并且只能合成已知化学结构的酶。,三、酶的生产,第三节 酶工程,提取法、发酵法和化学合成法三、酶的生产第三节 酶工程,1、细胞破碎处理 机械破碎法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎。物理破碎法

27、：利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎。化学破碎法：利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。酶学破碎法：选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎。,四、酶的提取和分离纯化,第三节 酶工程,2、酶的提取过柱法盐溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法等3、分离酶分离纯化的方法很多，可利用酶相对分子质量的大小进行分离纯化，如通过透析的方法分离酶等。,1、细胞破碎处理 四、酶的提取和分离纯化第三节,1、载体结合法 载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。物理吸附法、离子结合法、共价结合法。2、交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联

28、结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。3、包埋法 ：将酶包裹在多孔的载体中。,五、酶的固定化方法,第三节 酶工程,酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类：,1、载体结合法 载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法,（1）高果糖浆 葡萄糖经过异构化果糖。 生产上实际上只有42%45%，其余的仍然是葡萄糖。 把果葡糖浆中的果糖和葡萄糖分离，将分离出来的葡萄糖再次进行异构化，如此反复多次，最后的混合物中果糖的含量可以达到70%90%，形成高果糖浆。,六、酶的应用,第三节 酶工程,（1）高果糖浆 葡萄糖经过异构化果糖。六、酶的应用,加酶洗衣粉中添加了多种酶制剂，如

29、碱性蛋白酶制剂和碱性脂肪酶制剂等。 对人体没有毒害作用 不会污染环境。,（2）加酶洗衣粉,第三节 酶工程,加酶洗衣粉中添加了多种酶制剂，如碱性蛋白酶制,肌肉组织中含有胶原蛋白，由于存在着交联键而使肌肉具有很强的机械强度。用嫩肉粉处理年老畜禽的肌肉，可以使这类肌肉中的胶原蛋白水解，使肌肉变软并且易于烹调。,第三节 酶工程,（3）嫩肉粉,木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成。,肌肉组织中含有胶原蛋白，由于存在着交联键而使肌肉具有,传感器又叫变送器，是一类能将某一种被测物理量变换成便于传送和处理的另一种物理量（通常为电量）的器件或装置。例如，验钞器就是一种比较简单的传感器。,第三节 酶工程,（4

30、）酶传感器,传感器又叫变送器，是一类能将某一种被测物理量变换成便,菠萝蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等-胃分泌功能障碍。 L-天冬酰胺酶、白喉毒素-抗肿瘤，胰凝乳蛋白酶-治疗炎症，激肽释放酶-降血压，尿激酶-溶解血凝块。,第三节 酶工程,（5）医药医疗,菠萝蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等-胃分泌功能,1857年，法国微生物学家巴斯德发现了发酵原理，人们才认识到发酵是微生物活动的结果。,第四节 发酵工程（P147）,一、发酵工程的概念和内容二、发酵工程操作技术三、发酵工程的应用四、发酵工程产品氨基酸,1857年，法国微生物学家巴斯德发现了发酵原理，人,发酵工程：是指利用微生物的特定性状

31、，通过现代化工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术系统，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。 发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。,一、发酵工程的概念和内容,第四节 发酵工程,发酵工程：是指利用微生物的特定性状，通过现代化工程技,2、发酵工艺：:主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。3、下游工程：:指从发酵液中分离和纯化产品的技术。,第四节 发酵工程,发酵工程由三部分组成：,1、上游工程:包括利用常规方法、基因工程方法、细胞工程方法等选育优良种株，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养

32、组成）的确定，营养物的准备等。,2、发酵工艺：:主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞,(一)菌种的选育 ： 自然选育、诱变育种，例如，在1943年刚开始生产青霉素时，青霉素的产量只有20g/mL左右，经过长期的诱变育种，如今青霉素的产量已达到85 000g/mL以上。（二）培养基的配制 合适的培养基对细菌生长非常重要。（三）灭菌 发酵工程中所用的菌种大多是单一的纯种。（四）扩大培养和接种 在大规模的发酵生产中，需要多次扩大培养。,二、发酵工程操作技术,第四节 发酵工程,(一)菌种的选育 ： 自然选育、诱变育种，例如，在194,这是发酵工程的中心阶段和生产过程。在这个阶段，除了要随时取样

33、检测培养液中的细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程外，还要及时添加必需的培养基组分，以满足菌种的营养需要。同时，要严格控制温度、pH值、溶氧、通气量与转速等发酵条件。,第四节 发酵工程,（五）发酵过程,20世纪60年代，生物学家将计算机应用到发酵工程中，实现了对温度、pH值、通气量、转速等的自动记录和自动控制。,这是发酵工程的中心阶段和生产过程。在这个阶段，除了要,未转基因酵母,转基因酵母,第四节 发酵工程,未转基因酵母转基因酵母第四节 发酵工程,转基因高产胡萝卜素可食酵母体系的中试生产,转基因酵母 430 -1290ug/g 胡萝卜 31ug/g,第四节 发酵工程,转基因高产胡萝卜素可食酵母

34、体系的中试生产转基因酵母,胰岛素1000磅牛胰 10 克胰岛素200升发酵液 10 克胰岛素,干扰素1200升人血 1 升发酵液23万美元/病人 200300美元/病人,第四节 发酵工程,胰岛素干扰素第四节 发酵工程,（1）温度 温度影响酶的活性。金色链霉菌在30 以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35 时，则只合成四环素而不合成金霉素。灰色链霉菌最适生长温度是37 ，产生抗生素最适温度是28 。,第四节 发酵工程,（六）影响发酵过程的因素,（2）pH值 pH值能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，pH值还会影响培养基中营

35、养物质的分解等。,（1）温度 温度影响酶的活性。第四节 发酵工程（六）影响,（3）溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6 mol的氧。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，并要不断地进行搅拌，以提高氧在发酵液中的溶解度。（4）泡沫 在发酵过程中，通气搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的。常用的消泡沫措施有两类：一类是安装消泡沫挡板，通过强烈的机械振荡，促使泡沫破裂；另一类是使用消泡沫剂。（5）营养物质的浓度 发酵液中各种

36、营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。因此，在发酵过程中，也应根据具体情况进行控制。,第四节 发酵工程,（3）溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。从葡,应用发酵工程生产的产品有两类：一类是代谢产物，另一类是菌体本身，如酵母菌和细菌等。菌体可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。,第四节 发酵工程,（七）产物分离提纯,应用发酵工程生产的产品有两类：一类是代谢产物，另一类是菌体本,发达国家发酵工业的总产值占到国民生产总值的5左右。 生产出了种类繁多的药品，如抗生素、维生素、动物

37、激素、药用氨基酸、核苷酸(如肌苷)等。1、谷氨酸发酵生产2、单细胞蛋白,三、发酵工程的应用,第四节 发酵工程,发达国家发酵工业的总产值占到国民生产总值的5左右。,氨基酸主要用于食品、医药、农业、化妆品的生产等方面。 在食品工业上的应用 甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，食品添加剂。甘氨酸用于清凉饮料、肉汤、酱菜等的加工，不仅能增加甜味，还能缓和苦味。赖氨酸、蛋氨酸等人体必需的氨基酸常作为食品添加剂，用以提高食品的营养价值。,四、发酵工程产品氨基酸,第四节 发酵工程,氨基酸主要用于食品、医药、农业、化妆品的生产等方面。,在医药工业上的应用 氨基酸的混

38、合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。精氨酸药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳回复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝；甘氨酸、谷氨酸用于调节胃液；L-谷氨酸与L-谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障碍等。,第四节 发酵工程,在医药工业上的应用 第四节 发酵工程,在化妆品生产中的应用 氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤pH值和保护皮肤的功能。例如，胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。又如，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂，具有清洗、抗菌等功能，用于护肤品、洗发剂中。,第四节 发酵工程,在化妆品生产中的应用 氨基酸及其衍生物与皮肤的

39、成分,在农业上的应用 苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。 美国一家公司用甘氨酸制成了除草剂。不会造成环境污染。 赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改善肉的质量。,第四节 发酵工程,在农业上的应用 第四节 发酵工程,第五节 蛋白质工程（P155）,一、什么是蛋白质工程二、蛋白质结构分析,第五节 蛋白质工程（P155）一、什么是蛋白质工程,蛋白质工程是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。,一、什么是蛋白质工程,第五节 蛋白质工程,蛋白质工程也被称为第二代基因工程。,蛋白质工程是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过

40、周,二、蛋白质结构分析,第五节 蛋白质工程,RNase 的某些二级结构,血红蛋白四级结构,（一）蛋白质的分子结构,二、蛋白质结构分析第五节 蛋白质工程RNase 的某些二级结,基本方法：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化的小肽段的顺序；（3）根据肽段氨基酸顺序中的重叠区确定小肽段的排列次序；（4）完成整条多肽链的顺序分析。 尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序。,第五节 蛋白质工程,（二）蛋白质结构的推测与测定,1、一级结构测定,基本方法：第五节 蛋白质工

41、程（二）蛋白质结构的推测,蛋白质三维结构很大程度上决定了蛋白质的功能，目前应用X射线晶体衍射图谱法和核磁共振法已测定出1万多种蛋白质及其复合物的结构，但与已测得的30多万种蛋白质序列相比，还有很大的差距。,第五节 蛋白质工程,2、蛋白质高级结构预测,（1）比较建模法（2）反向折叠法（3）从头预测法,蛋白质三维结构很大程度上决定了蛋白质的功能，目前应用,根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：晶体中:应用X射线晶体衍射图谱法和中子衍射法。溶液中:应用核磁共振法、园（圆）二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等。 其它方法在应用上存在较大的局限性。,第

42、五节 蛋白质工程,3、蛋白质三维结构实验测定,根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类,（三） 蛋白质的创造和改造一是小范围改造，少数几个残基的替换；二是较大程度的改造，是对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，期望转移相应的功能；三是蛋白质从头设计。,第五节 蛋白质工程,1、定点突变2、盒式突变 3、蛋白质融合4、蛋白质的从头设计,（三） 蛋白质的创造和改造第五节 蛋白质工程1、定点突变,第六节 分子杂交与遗传标记（P158）,一、分子杂交二、遗传标记三、分子标记技术的应用,第六节 分子杂交与遗传标记（P158）一、分子杂交,（1）Southern blot杂交,第六节 分子杂交

43、与遗传标记,一、分子杂交,（1）Southern blot杂交第六节 分子杂交与遗传,（2）Northern blot杂交（3）Western blot杂交,第六节 分子杂交与遗传标记,Northern blot杂交,Western blot杂交,（2）Northern blot杂交第六节 分子杂交与遗传标,遗传标记：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。遗传标记包括形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。,第六节 分子杂交与遗传标记,二、遗传标记,（一）形态标记主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等，也包括色素、生理特性、生殖特性、抗

44、病虫性等有关的一些特性。形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响。,遗传标记：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座,细胞学标记即细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。,第六节 分子杂交与遗传标记,（二）细胞学标记,细胞学标记即细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色体,生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指不同基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从动植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法

45、将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,（三）生化标记,第六节 分子杂交与遗传标记,生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指不同基,分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,第六节 分子杂交与遗传标记,（四）分子标记,(1)高的多态性(2)共显性遗传(3)能明确辨别等位基因(4)遍布整个基因组(5) 均匀分布于整个基因组(6)选择中性；(7)检测手段简单、快速；(8) 成本低廉；(9) 重复性好。,分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA,限制性片段长度多态性（缩写RFLP）是发展最早的分子标记技术。RFLP

46、技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变和一段DNA的插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化等均可导致RFLP的产生。,第六节 分子杂交与遗传标记,1、RFLP,限制性片段长度多态性（缩写RFLP）是发展最早的分子,印 迹 法,内切酶切开DNA,电泳,印迹转移,放射性探针杂交,胶片显影,第六节 分子杂交与遗传标记,印 迹 法内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针胶片显影,第六节 分子杂交与遗传标记,对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。,第六节 分子

47、杂交与遗传标记 对线粒体和叶绿体DNA进行,PCR(聚合酶链式反应) 由Mullis等于1985年首创。经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍。,第六节 分子杂交与遗传标记,2 、PCR技术及其在分子标记中的应用,（1）AP-PCR（2）随机扩增多态性DNA(缩写RAPD)：（3）DAF：（4）AFLP（5）STS,PCR(聚合酶链式反应) 由Mullis等于1985,第六节 分子杂交与遗传标记,第六节 分子杂交与遗传标记,第六节 分子杂交与遗传标记,简单重复序列(SSR)：即微卫星DNA，是一类由几个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，不同遗传材料重复次数的

48、可变性，导致了SSR长度的高度变异性。,3、SSR（SSLP）,第六节 分子杂交与遗传标记 简单重复序列(SSR)：即,染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。,第六节 分子杂交与遗传标记,4、染色体原位杂交,染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交,1、司法鉴定 亲子鉴定、生物技术侦破案件等都是应用分子标记中的简单、快速的PCR技术及其在相关方法。 2006年5月英国“泰唔士报”、美国“纽约时报”报道,根据英国“牛津祖先”公司的DNA检测,美国迈阿密大学48岁会计学教授汤姆罗宾逊是成吉思汗的后裔;6月份改为美国休斯敦“族谱DN

49、A”公司进行第二次检测，证实并非成吉思汗的后裔。,三、分子标记技术的应用,第六节 分子杂交与遗传标记,王纳文,1、司法鉴定三、分子标记技术的应用第六节 分子杂交与,2、分子遗传图谱的构建,第六节 分子杂交与遗传标记,几乎所有重要农作物的RFLP图谱均已构成,基因定位,分子标记辅助育种选择,基因图位克隆,2、分子遗传图谱的构建第六节 分子杂交与遗传标记几乎所有重要,第六节 分子杂交与遗传标记,3、遗传多样性与种质鉴定,第六节 分子杂交与遗传标记3、遗传多样性与种质鉴定,4、重要农艺性状相关基因的定位,第六节 分子杂交与遗传标记,4、重要农艺性状相关基因的定位第六节 分子杂交与遗传标记,第六节 分

50、子杂交与遗传标记,5、分子标记辅助选择,第六节 分子杂交与遗传标记5、分子标记辅助选择,6、重要性状的图位克隆,建立在分子标记遗传图谱基础上，克隆目的基因。,无须事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表达产物是什么就可以直接克隆基因。,第六节 分子杂交与遗传标记,6、重要性状的图位克隆建立在分子标记遗传图谱基础上，克隆目的,1、徐永华，动物细胞工程化学工业出版社P55-652、黎裕 贾继增 王天宇 分子标记的种类及其发展，生物技术通报，1999年第4期19-223、季静，山村三郎，西原昌宏，王罡，小岩宏之，朱长甫，通过转基因提高-胡萝卜素生物合成量，中国生物化学与分子生物学报，2004，2