临床免疫学检验课件第18章补体的检测及应用.ppt

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1、,第十七章 补体检测及应用,第十七章 补体检测及应用,第一节 补体的理化特性及生物学功能 第二节 血清总补体活性测定 第三节 单个补体成分的测定 第四节 补体参与的试验 第五节 补体测定的临床意义 思考与小结,第一节 补体的理化特性及生物学功能,第一节 概 述,补体：人和脊椎动物血清，具有酶样活性、不耐热 的糖蛋白其存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人 血清中含量相对稳定，某些疾病时，含量及 其活性可发生改变。补体含量与活性的测定，对机体免疫状态的 评价和疾病的诊断具有重要意义。,第一节 概 述补体：,分 类,一、 补体的理化特性与生物学功能,根据补体系统的生物学功能，可将其分为： 补体固有成

2、分、补体调节蛋白、补体受体(complement receptor, CR)三大部分。,分 类一、 补体的理化特性与生物学功能根据补体系统的生物学,补体理化性质,由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属球蛋白含量约占血清球蛋白总量的10%，其中C3含量最高、D因 子含量最低固有成份间的分子量差异较大，其中C1q最大、D因子最小。不同种属中补体含量不同，豚鼠血清中含量丰富（实验室补体来源）稳定性：对热不稳定，56C、30min即被灭活，010 C条件下活性只能保持34d。多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体,补体理化性质由

3、肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,经典途径,二、补体的活化途径,经典途径二、补体的活化途径,补体系统三条激活途径示意图,补体系统三条激活途径示意图,三 种 途 径 比 较,三 种 途 径 比 较,补体的生物学功能,1.溶解细胞、细菌和病毒：抗原抗体复合物激活补体,形成攻膜复合体，导致靶细胞裂解，介导特异和非特异免疫应答，发挥免疫防御与损伤双层作用。2.调理作用：细菌-Ag-Ab-补体片段（C3b4biC3b等）-中性粒细胞或吞噬细胞补体受体结合，介导吞噬。3.引起炎症反应:补体产生C3a4a5a等过敏毒素，使肥大细胞和嗜碱细胞脱颗

4、粒，释放组氨等生物活性介质，增加血管通透性和平滑肌收缩，同时介导吞噬细胞的向炎症部位趋化，引起炎症反应。,补体的生物学功能1.溶解细胞、细菌和病毒：抗原抗体复合物激活,4.清除免疫复合物：中等IC沉积血管壁，引起组织损伤。改变Ig的空间结构，抑制其结合新的抗原表位，抑制形成新的IC；另一方面空间干扰IgFc段的相互作用，促进复合物溶解；Ag-Ab-补体-表达C3b受体-靶细胞（红细胞、血小板），血液运送至肝脏，较大复合物遭清除。5.免疫调节作用：ADCC,C3固定抗原，易被APC处理，补体C3d与BCR结合，介导B的活化，并增殖为浆细胞,4.清除免疫复合物：中等IC沉积血管壁，引起组织损伤。,

5、第二节 补体总活性测定,血清总补体活性测定可反映补体的整体功能，是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50（50% complement hemolysis) 补体活化途径不同，应用不同的激活物可活化不同的补体途径基于经典途径的CP-CH50（临床常规项目）脂质体均相免疫溶解试验应用于C3旁路检测的AP-CH50（尚未列入检验常规）,第二节 补体总活性测定血清总补体活性测定可反映补体的整体功能,一 CP-CH50测定法的原理,（一）实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用，这种活性很容易通过溶血反应进行检测。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时

6、，溶血程度与补体含量和活性相关（sRBC-溶血素激活补体，导致靶细胞溶解）。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一个特殊的S形曲线。,一 CP-CH50测定法的原理（一）实验原理,溶血程度与补体含量的关系,在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在3070%溶血时，S曲线最抖，补体含量出现少许变动，会造成溶血程度较大的改变，此阶段对补体量的变化非常敏感。,溶血程度与补体含量的关系,故采用50溶血作为终点指标要比100溶血敏感得多，这一方法称为补体50溶血(complement hemolysis 50)，简称为CH50,

7、故采用50溶血作为终点指标要比100溶血敏感得多，这一方,（二）CH50测定方法,1.红细胞浓度的调整,绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4保存备用。使用前，调制成2%5% SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入2030倍的稀释液，在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。,（二）CH50测定方法1.红细胞浓度的调整绵羊红细胞（SRB,2.溶血素滴定,溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化试验前需先行加热56 30min或60 3min以灭活补体溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用自行制备的

8、溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用2个单位。溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定,2.溶血素滴定溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化,3.稀释缓冲液 ：PBS(适量钙和镁离子）4. 50%溶血标准管：2%SRBC 0.5ml+蒸馏水2.0ml,完全溶血。再加2.5ml缓冲液则为50%溶血5. 50%溶血总补体值的计算CH50(U/ml)=(1/终点管稀释血清的用量）稀释倍数,3.稀释缓冲液 ：PBS(适量钙和镁离子）,血清总补体活性测定,血清总补体活性测定,结果测定:2500r/min离心5min，观察结果，选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上

9、分别读取吸光度，以最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，取其血清用量、稀释倍数代入下列公式，求得CH50的测定值（单位U）。,血清总补体活性（U/ml ）,稀释倍数,1 血清用量,结果测定:,（三）方法评价与临床意义,方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关 总补体活性的参考范围为50100U/ml CH50增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤、糖尿病CH50降低见于：严重肝病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球肾炎等,（三）方法评价与临床意义方法简便、快速，但敏感性低，补体的活,二、脂质体均相

10、免疫溶破试验,试剂1：脂质体，其内部水相中包入水溶性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH），双层内包裹抗原-二硝基苯酚（DNP）。 试剂2：羊抗DNP抗体和酶底物，底物为6磷酸萄萄糖（G6P）和辅酶1（NAD） 反应过程：羊抗DNP抗体与脂质体上DNP结合成抗原-抗体复合物，待测血清中的补体被激活，攻击破坏脂质体膜，释放出G-6-PDH与酶底物（G6P和NAD）发生反应，产生NADH。,二、脂质体均相免疫溶破试验试剂1：脂质体，其内部水相中包入水,340nm处测吸光度（A），A值与待测血清中的补体活性成一定比例关系。该法不使用SRBC，血清用量少，影响因素少，操作简便、快速准确，适用于,3

11、40nm处测吸光度（A），A值与待测血清中的补体活性成一定比例关系。 该法不使用SRBC，血清用量少，影响因素少，操作简便、快速准确，适用于自动分析仪测定,340nm处测吸光度（A），A值与待测血清中的补体活性成一定,三、AP-CH50,为测定血清补体旁路激活途径溶血功能的试验。 原理:是家兔红细胞未经致敏可直接激活人血清中的B因子，引起旁路途径活化，导致兔红细胞溶解 溶血程度与血清中参与旁路激活途径的补体量及活性呈正相关。与CP-CH50测定相似，可计算出待检血清中补体旁路激活途径的溶血活性，以AP-CH50kU/L表示测定时缓冲液中加入乙二醇双氨基四乙酸（EGTA)可与待测血清中的Ca2+

12、螯合，阻断补体经典激活途径,三、AP-CH50为测定血清补体旁路激活途径溶血功能的试验。,为测定血清补体旁路激活途径溶血功能的试验。 兔红细胞用枸橼酸盐抗凝，洗涤后配成0.5%兔红细胞悬液备用。兔红细胞用枸橼酸盐抗凝，洗涤后配成0.5%兔红细胞悬液备用。,为测定血清补体旁路激活途径溶血功能的试验。,第三节 单个补体成分的测定,常作为单个补体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等测定方法： 免疫溶血法 （检测单个补体成分的活性） 免疫化学法（检测单个补体成分的含量）,第三节 单个补体成分的测定常作为单个补体成分的检测指标：C3,一、免疫溶血法,定义:根据抗原与其特异性抗体结

13、合后激活补体的经典途径，导致靶细胞溶解。指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统两组补体:其一：以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照，不溶血其二：待测血清标本（若含补体），加入后恢复溶血结果判度:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的量呈正比，仍以50溶血为终点,一、免疫溶血法 定义:根据抗原与其特异性抗体结合后激活补体的,参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清 免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3、

14、C4两成分的检测更为常见该法无需特殊仪器与设备，试验快速简便，但敏感性较低，影响因素较多，仅能测定某一补体成分的活性，而不能测定其含量。,参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分,二、免疫化学法,免疫化学法分类 1.单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳 3.透射比浊法 4.散射比浊法 5.ELISA 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰 后两种方法：通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定 ELISA具有操作简单、敏感性高、特异性强、可以自动化等优点，不仅对补体系统单个成分可进行定性检测，也可定量检测。,二、免疫化学法,二、免疫

15、化学法免疫化学法分类 1.单向免疫扩散二、免疫化学,二、免疫化学法,目前对补体C1C9的11种蛋白成分、B因子、D因子、P因子、MBL、FCN、MASP、C1INH、H因子、I因子、C4结合蛋白（C4bp）以及补体的裂解产物C4a、C4b、C2a、C2b、C3a、C3b、iC3b、C3c、C3d、C5a、C5b等均已有商品化的ELISA 检测试剂盒。 。,二、免疫化学法,第四节 补体参与的试验,一、补体结合试验补体结合试验(complement fixation test，CFT): 将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。1905年，用于梅毒的诊断，即华氏反应。除

16、了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关抗原以及HLA血清学分型中也有应用,第四节 补体参与的试验,（一）、试验原理,有5种成分参与反应，分属于3个系统：反应系统: 即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）补体系统:指示系统: 即SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。,（一）、试验原理 有5种成分参与反应，分属于3个系统：,反应分两步进行 第一步:反应系统与补体的作用 第二步:指示系统利用剩余补体的反应,不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性,反应分两步进行 不溶血为

17、补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,（二）、补体结合试验方法,（二）、补体结合试验方法,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,（二） 血清标本,采血并及时分离血清用于检测或20保存备用。试验前，应先将血清56加热30min（或603min）以灭活补体。,（二） 血清标本采血并及时分离血清用于检测或20保存备用,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,（二）正式试验,结果判断:对照管: 阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗

18、体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血,（二）正式试验,补体对照管： 受检血清 阳性:不溶血 阴性:溶血注意: 若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。,2个单位:全溶1个单位:全溶或略带少许红细胞0.5个单位:不发生溶血,2个单位:全溶,（三）、方法评价,优 点灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05g/ml的抗体,可与间接凝集法的灵敏度相当。特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。试验结果显而

19、易见；易于普及，试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。,（三）、方法评价 优 点,现 状影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用,现 状,补体结合试验的应用： 补体结合试验在抗原抗体的定性和定量以及抗原性差异分析中都有着广泛的应用。抗体的检测病原性抗原及相应抗体的检测抗原的检测例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等自身抗体检测,补体结合试验的应用：,正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞等是带有特异性抗原的靶细胞与

20、相应抗体结合后，在补体的参与下，可导致靶细胞膜损伤、通透性增加、细胞死亡，而不带特异抗原的细胞仍存活。伊红-Y或台盼蓝等染料可通过损伤的细胞膜进入细胞，使损伤死亡或濒死细胞着色，而活细胞不着色。可用于检测细胞膜抗原（如HLA分型、T细胞表面抗原等），也可用于鉴定抗体的特异性。,二、补体依赖的细胞毒试验,二、补体依赖的细胞毒试验,免疫粘连血凝试验：可检测多种病毒及其抗体，利用抗原和抗体结合，在补体存在条件下，可使人O性红细胞发生凝集溶血空斑试验：可检测抗体形成细胞（AFC）。用经SRBC免疫小鼠脾细胞（含SRBC激活的B细胞）+SRBC在凝胶中混匀，加补体，导致溶血形成肉眼可见的溶血空斑胶固素结

21、合试验：可检测循环免疫复合物。C1q抗体测定试验：常用ELISA法检测，多种自身免疫性疾病患者的血清中可检测到C1q抗体，其含量与疾病病情呈正相关。如SLE,三、补体参与的其他试验,三、补体参与的其他试验,第五节 补体测定的临床意义,第五节 补体测定的临床意义,一、补体活性与含量增高各种传染病组织损伤急性炎症某些肿瘤患者心肌梗死糖尿病妊娠病情危重时，总补体活性常呈下降趋势,一、补体活性与含量增高,二、补体活性与含量降低或缺陷,1.先天性某些补体成分缺陷C1INH缺陷：可致遗传性血管神经性水肿。C2、C3缺陷：可导致严重的感染。衰变加速因子（DAF）和膜反应性溶破抑制物（MIRL）缺陷：可导致阵

22、发性夜间血红蛋白尿。补体受体1（CR1）缺陷：可导致循环IC的清除障碍。I因子、H因子缺陷：可引起肾小球肾炎。C1q缺陷：可引起严重顽固性皮肤损害。C1q、C1r、C4、C2缺陷：可致免疫复合物性血管炎（包括肾炎）。,二、补体活性与含量降低或缺陷1.先天性某些补体成分缺陷,2.后天性获得性补体活性与含量降低补体消耗增多：系统性红斑狼疮（SLE）、与型超敏反应、自身免疫性溶血性贫血、冷球蛋白血症、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、移植排斥反应等疾病时，补体消耗增加，导致血清补体活性与含量降低。其降低程度与疾病的活动、进程和疗效等有关。补体大量丢失：如大面积烧伤、大出血和肾病综合征等，可使大量体液和蛋白

23、质丢失，导致补体活性与含量降低。补体合成不足：肝细胞受损或大量破坏、机体营养不良等可使补体的合成减少，导致血清补体活性与含量降低。肝病时血清补体活性与含量降低的顺序依次为慢性肝炎、肝细胞癌、肝硬化和重症肝炎。,2.后天性获得性补体活性与含量降低,三、补体裂解产物检测的临床应用,型超敏反应的发病机制与补体活化后产生的C3a、C5a等裂解产物（称为过敏毒素）有关。型超敏反应性疾病可测定补体裂解产物C3a、C5a等，来了解疾病的进展程度。,三、补体裂解产物检测的临床应用型超敏反应的发病机制与补体活,本章小结,补体有30余种成分，存在于正常人或脊椎动物血清、组织液和细胞膜表面。补体性质不稳定易受理化因

24、素影响而失活。补体系统可通过三条途径激活，发挥溶细胞溶菌溶病毒、调理吞噬、清除免疫复合物、介导炎症反应等生物学作用。可通过血清总补体活性测定（CH50）和单个补体成分的含量及其活性的测定，来评价机体内补体系统的状况，对疾病的诊断、鉴别、疗效观察以及发病机理的研究等均有着重要的意义。补体参与的试验对于开展各种抗原或抗体以及免疫复合物的检测，具有非常重要的临床应用价值。,本章小结补体有30余种成分，存在于正常人或脊椎动物血清、组织,(图)血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病,1免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4等缺陷；超敏反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏

25、毒素的产生。2与补体有关的遗传性疾病： C2、C3缺陷导致的严重感染； 与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿 SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与CIC清除障碍 涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎； DAF（衰变加速因子）缺陷引起的阵发性血红蛋尿； C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、 C1r、C4、C2缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,(图)血管神经性水肿,(图)血管神经性水肿补体含量和活性相关的疾病1免疫相关性疾,3补体含量显著降低的疾病：消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE.补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者补体合成不

26、足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。4高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,临床免疫学检验-课件-第18章-补体的检测及应用,小结,补体是重要的参与固有免疫的可溶性球蛋白分子，同时有助于特异性抗体产生后效应的发挥，可有效地清除机体的可溶性免疫复合物，发挥彻底排除异物的功效。与此同时，也可通过清除抗原抗体反应形成于组织或细胞膜上的复合物，造成炎症损伤，参与疾病的形成过程。,补体清除可溶性免疫复合物，与补体的溶细胞作用和调理吞噬作用的发挥相关。,补体的检测，主要是根据补体的抗原性和溶细胞活性设计的。补体检测的方法涉及总补体活性的测定和单个补体成分

27、的检测，其中总补体活性测定，在临床应用广泛者当数经典途径的CH50检测法；而单个补体成分检测则包括溶血法与免疫化学法，后者可用于定量测定。,小结补体是重要的参与固有免疫的可溶性球蛋白分子，同时有助于特,（一)名词解释1.补体 2.CH50 3.补体结合试验（二）问答题1.已知补体的活化有三条途径，试述三条激活途径有何不同？2.试述补体在抗感染免疫中有何作用？ 3.试述总补体活性测定的方法、原理、结果判断和临床意义。4.简述补体结合试验的原理、结果判断和方法学评价?,思考题,（一)名词解释思考题,1.正常血清中,补体含量最高的是A.C1B.C2C.C3D.C4E.C52.在CH50 试验中,溶血

28、程度与补体含量的关系为A.直线B.抛物线C.双曲线D.S形曲线E.正态分布,1.正常血清中,补体含量最高的是,3.CH50试验是以什么作为终点指标A. 100%溶血B. 80%溶血C.75%溶血D. 50%溶血E. 25%溶血4.识别抗原抗体复合物的补体是A .C1sB.C1rC. C1qD.C2E.C1qrs,3.CH50试验是以什么作为终点指标,5.下列关于补体的特点,不正确的是A.补体的性质不稳定B.标本保存应置于-20以下C.在010活性保持34天D.加热5630min灭活E.不受各种理化因素的影响6.关于补体结合试验,错误的是A.敏感性高B.特异性强C.易出现交叉反应D.反应结果明显

29、E.试验条件要求低,5.下列关于补体的特点,不正确的是,7.可用于检测血清中补体经典途径的溶血活性的试验是（ ）A.CH-CP50 B AP-CH50 C 补体结合试验 D 补体依赖性细胞毒试验 E 溶血空斑试验8.测定单个补体成分的溶血活性时，用氨处理可去除的补体成分是（ ）A.C1 B. C2 C. C3 D. C4 E. C59.补体结合试验的指示系统是（ ）A.特异性抗体与待测抗原 B. 特异性抗原与待测抗体 C 特异性抗体与补体 D. SRBC 与溶血素 E. 特异性抗原与抗体,7.可用于检测血清中补体经典途径的溶血活性的试验是（,10.测定单个补体成分含量的检测方法不包括 （ ）A.免疫比浊法 B. 单向免疫扩散法 C. 火箭免疫电泳法 D 酶联免疫吸附试验 E.溶血空斑试验11.脂质体均相免疫溶破试验与CP-CH50相比，其主要优点是（ ）A.不使用SRBC、血清用量少、影响因素少 B 操作简便C. 反应快速 D. 结果准确 E.敏感性高,10.测定单个补体成分含量的检测方法不包括 （ ）,