临床免疫学检验课件第8章荧光免疫技术.ppt
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1、第八章 荧光免疫技术,Fluoroimmunoassay, FIA,第八章 荧光免疫技术 Fluoroimmunoassa,概念:是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。方法: 荧光抗体技术(FAT): 用荧光素标记抗体进行抗原定位、定量检测等。,荧光免疫技术,概念:是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种,第一节 荧光免疫试验的组成要素,1.荧光:某些物质受到一定波长光的激发后,在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2.产生机制: 基态-能量(波长短的光)-激发态-荧光(波长长的光,光致发光)-基态,一、荧光的基本知识,化学物质,基态,吸收能量,释放能
2、量:发光,激发态,第一节 荧光免疫试验的组成要素1.荧光:某些物质受到一定,3.特点: 即时性(停止供能,荧光现象即止10-710-8s) 4.能量来源:光、化学物质、射线。,3.特点:,1.发射光谱:固定激发波长,在不同波长下所记 录到的样品发射荧光的相对强度。2.激发光谱:固定发射波长,用不同波长的激发光 激发样品,所记录到的相应的荧光发射强度。3.荧光效率:是指荧光物质将吸收的光能转变成 为荧光的百分率。 荧光效率发射荧光的光量子数(荧光强度)/ 吸收光的光量子数(激发光强度),有关参数,取决于荧光色素本身的物理特性,1.发射光谱:固定激发波长,在不同波长下所记有关参数取决于荧,4.荧光
3、的淬灭: 指荧光物质在某些理化因素作用下,发射荧光减弱甚至消退的现象。原因: (1)紫外光照射长; (2)苯胺、酚、铁、汞、镍等。有利:猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯 处理有荧光的镜油。 保存:避光、避免与其它化学物质接触,4.荧光的淬灭:,二、荧光物质(一)荧光色素:具有光致荧光的特性。,1、荧光色素应具备的条件 P87 能与蛋白质共价结合,结合蛋白质后不易解离,而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除 荧光效率高 荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 结合蛋白质后,不影响蛋白质的生化性质及免疫 学活性,而且标记方法简单、快速,结合物稳 定,易于保存。 安全无毒,不具有附加的抗原性。,
4、二、荧光物质(一)荧光色素:具有光致荧光的特性。1、荧光色,2、常用的荧光色素:(1)异硫氰酸荧光素(FITC) 最大吸收光谱: 490-495nm 。最大发射光谱: 520-530nm 。荧光颜色: 黄绿色。应用最广: 人眼对黄绿色较橘色更为敏感。 一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红色的,本底低 。缺点:易猝灭,2、常用的荧光色素:,(2)四乙基罗丹明 (RB200)最大吸收光谱: 570nm 。最大发射光谱: 595-600nm 。荧光颜色: 亮橙、橘红色。应用: 常用于双重标记或对比染色。可作为FITC的补充,但其荧光效率较低。,(2)四乙基罗丹明 (RB200),(3)四甲基异硫氰酸
5、罗丹明 (TRITC) 最大吸收光谱: 550nm 。最大发射光谱: 620nm 。荧光颜色: 橘红色。应用: 常用于双重标记或对比染色; 激发峰和荧光距离较大,易于选择滤光系统。,(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC),(4)藻红蛋白( PE)最大吸收光谱: 565nm 。最大发射光谱: 575nm 。荧光颜色: 橙色。应用: 常可作为FITC的补充。,(4)藻红蛋白( PE),(二)其他荧光物质1、镧系螯合物 铕(Eu3+)(应用最广)、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物应用:荧光衰变时间长,用于时间分辨荧光免疫测定2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶(4-甲基
6、伞酮磷酸盐)、辣根过氧化物酶(对羟基苯乙酸)的底物。应用:酶免疫荧光分析,(二)其他荧光物质,3、花菁染料 (Cyanine Dyes,Cy2,Cy3,Cy5) 荧光特性与传统荧光素类似,但水溶性和对光稳定性较强,荧光量子产率较高,对pH等环境不敏感。常用于多重染色。 Cy2比FITC更稳定,荧光强度更大,光稳定性和抗淬灭性更好。 Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮,更稳定,背景更弱。 Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察,因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。,3、花菁染料 (Cyanine Dyes,Cy2,Cy3,C,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,临床免疫学检验-
7、课件-第8章-荧光免疫技术,荧光显微镜观察,高压汞灯:波长不连续:365nm435nm (紫外光或蓝紫光) 只能用作荧光激发光源氙灯 卤素灯,光源有一定寿命:标本要集中观察,荧光显微镜观察1、荧光显微镜高压汞灯:波长不连续:365n,2)滤片系统:激光滤片(exciter filter): 位置:光源和物镜之间 作用:使短波长的光通过、吸收长波长的光紫外光滤片: UG 通过275nm400nm 阻挡400nm以上的可见光 组织的自发荧光弱,呈灰蓝色蓝紫外光滤片: BG 通过325nm500nm 荧光强度大,适于观察细菌标本; 不适于观察有自发荧光的组织标本,2)滤片系统:,阻挡滤片(barri
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- 临床 免疫学 检验 课件 荧光 免疫 技术
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