临床免疫学检验课件第13章流式细胞分析技术1.pptx
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1、第十三章 流式细胞分析技术,第十三章 流式细胞分析技术,概 述,流式细胞术(flow cytometry,FCM):是基于流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微粒(细胞)的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分选的新型技术。流式细胞术的特点:快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能,或根据微粒(细胞)的特征进行分选,进而研究其生物学特征和功能。,概 述流式细胞术(flow cytometry,FCM):,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理,一、概 述,流式细胞仪(flow cytometer):是多学科交叉融
2、合的产物,是集光学、化学、材料学、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新型分析仪器。作为一种先进的微粒(细胞)定性和定量分析仪器。流式细胞仪特点:速度快,每秒可测量数万个微粒;精度高;准确性好;多参数测量,可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特性的多参数测量。,一、概 述流式细胞仪(flow cytometer):,二、经典流式细胞仪,(一)基本结构 经典分析型的流式细胞仪的结构组成液流系统:液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 信号检测:光源、光束形成器(流动室前光学系统)、流动室后光学系统 转换及放大系统:光电转换器、放大器和信
3、号处理电路 计算机分析系统分选型流式细胞仪分选系统:荧光激活细胞分选系统(FACS),二、经典流式细胞仪 (一)基本结构,经典流式细胞仪的结构,经典流式细胞仪的结构,(二)分析工作原理荧光染色待测单细胞悬液 进样器系统 液流 细胞流 驱动系统 流动室 鞘 液 单细胞流 检测区域 激光 激发细胞 荧光素 PMT/PD检测器 信号放大 FSC/SSC 计算机 信号转换、储存和分析。,(二)分析工作原理,液流系统和液流聚焦示意图,液流系统和液流聚焦示意图,液流系统和光学系统,样品流,喷嘴荧光信号激光束聚焦鞘液液流系统和光学系统样品流,光学系统、样品激发和FSC检测,Original from Pur
4、due University Cytometry Laboratories,光学系统、样品激发和FSC检测Original from P,光学系统、样品激发和SSC检测,光学系统、样品激发和SSC检测,光学系统、样品激发和荧光检测,光学系统、样品激发和荧光检测,光学系统和荧光检测,光学系统和荧光检测,(三)分选工作原理 单细胞流 流动室 超声压电晶体高频振动 散射光 单细胞液滴 选定细胞群体 荧光信号 加载电荷 偏转高压静电场 液滴偏转 进入分选收集管,完成细胞分选 数据储存,分析。,(三)分选工作原理,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含
5、细胞的液,分选的技术要求:分选速度:单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度:分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率:实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率:从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,分选的技术要求:,二、量化成像分析流式细胞仪,(一)基本结构量化成像分析流式细胞仪(imaging flow cytometer)的组成:荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪的结合体。 液流系统:注射泵、流动室、鞘液流和细胞流 LED灯 明场细胞显微图像 光学系统
6、: 荧光显微系统 全固态激光器 流式细胞仪检测 检测系统:TDI CCD,二、量化成像分析流式细胞仪 (一)基本结构,(二)分析工作原理细胞悬液 注射泵 流动室 液流聚焦系统鞘液 LED照射极限层流 抑制细胞搏动、翻转 明视野细胞形态 固态激光 TDI CCD捕获信号 散射光和荧光信号 计算机分析系统 细胞明视野、荧光图像和流式分析图,(二)分析工作原理,量化成像分析流式细胞仪结构、原理,A.量化成像分析流式细胞仪结构图B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图,量化成像分析流式细胞仪结构、原理 A.量化成像分析流式细胞仪,细胞核转位检测,细胞核转位检测,三、质谱流式细胞仪,(一)基本结构质谱流式细
7、胞仪(mass cytometer)的组成质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结合体。进样雾化系统离子源:热气化室和电感耦合等离子体焰炬 离子传递和过滤系统ICP-TOF检测系统计算机及其分析系统,三、质谱流式细胞仪(一)基本结构,质谱流式细胞仪结构简图,质谱流式细胞仪结构简图,(二)分析工作原理 金属元素偶联抗体 标记细胞 进样器 雾化系统 单细胞雾化液滴 离子源 原子电离 带电粒子 高频交变电磁场 雪崩式放电 涡流电流 离子云形成 ICP-TOF检测 计算机系统 数据处理和分析 经典流式细胞仪图,(二)分析工作原理,质谱流式细胞仪工作原理,质谱流式细胞仪工作原理,质谱流式常用标记元素
8、,质谱流式常用标记元素,常用外周血抗CD分子抗体标记元素,常用外周血抗CD分子抗体标记元素,质谱流式细胞仪结果分析,质谱流式细胞仪结果分析,第二节 数据的显示与分析,第二节 数据的显示与分析,一、参数,流式细胞仪的主要参数有两大类:散射光信号:前向散射光和垂直散射光荧光信号:各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号数量不同,随着配置的激光器越多,可检测的荧光信号越多。 分析型流式细胞仪最高标配4个激光器( 488、633、405和375 nm),可检测20个参数(18种荧光),而定制型可配置11个激光器,30个检测器,可测定 32个参数。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器,检测24个参数(2
9、2种荧光),可6路分选。,一、参数流式细胞仪的主要参数有两大类:,二、散射光的测定,(一)前向散射光(forward scattered light,FSC)是与细胞切线方向小角度散射光,其能反映细胞形状和体积大小。,二、散射光的测定(一)前向散射光(forward scatt,二、散射光的测定,(二)侧向散射光或垂直散射光(side scattered light,SSC)激光照射到细胞内容物时,可以产生方向不同和强弱不等的散射光,垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信息。,二、散射光的测定(二)侧向散射光或垂直散射光(side sc,三、荧光
10、测量,(一)荧光信号测量与放大器 荧光信号由被检细胞上标记的荧光抗体上的荧光素受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。散射光和荧光的强度决定了峰值脉冲信号的高度,荧光的分布则决定了脉冲信号的宽度。这些光谱通过滤光片,不同波长的散射光和荧光信号被分开,经PMT和PD检测后,信号经放大、转换,最后通过计算机分析获取流式结果。,三、荧光测量(一)荧光信号测量与放大器,流式检测示意图,流式检测示意图,(二)荧光补偿荧光补偿是指不同的荧光素由于发射光谱重叠,因此在检测的时候有串色现象,通过减去重叠部分的光,使检测器检测到的光能量是真正的某一荧光素产生的光能量。,(二)荧光补偿,临床免疫学检验-课件
11、-第13章-流式细胞分析技术1,四、数据显示方式,(一)单参数数据的显示单维参数(荧光或散射光)与细胞数量(count)构成,用于FSC、SSC和荧光(FL1FLn)等单参数的数据显示。,四、数据显示方式 (一)单参数数据的显示,(二)双参数图 二维散点图、密度图和等高图,(二)双参数图,(三)多维参数的显示假三维图和三参数点图,(三)多维参数的显示,三参数以上的显示 主要要依据设门技术进行分析,三参数以上的显示,(四)设门分析技术Gate设置:指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。Regi
12、on设置:区阈(region, R)与门(gate, G)是两个相关的概念,区阈可与门对应,但是也可以包含于门。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,(四)设门分析技术,R3=Q1+Q2+Q3+Q4Q1 =CD4+/CD3-Q2 =CD4+/CD3+Q3 =CD4-/CD3-Q4= CD4-/CD3+,R1=为粒细胞R2 =单核细胞R3 =淋巴细胞,M1为线性门,为是R3中的T淋巴细胞,R3=Q1+Q2+Q3+Q4Q1 =CD4+/CD3-Q,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,一、实验基本原则,FCM试验中实验设计
13、、对照设置、荧光抗体的选择、标本处理、染色过程和质量控制都对实验结果又重要影响。标本处理实验室环境 临床标本处理的实验室环境以及废弃物的处理要严格按照实验室安全要求进行,对于传染病标本应该按照传染病的等级,按照病原微生物实验室生物安全管理条例规定在不同等级的实验室中进行。工作人员按要求穿戴相关的防护服,仪器消毒、排放的气体、废水和实验废弃物也应按照要求进行处理。活细胞分选应该在万级层流室中进行。,一、实验基本原则FCM试验中实验设计、对照设置、荧光抗体的选,二、单细胞免疫标本的制备,(一)标本采集、运输、保存和操作1标本来源 主要来源于外周血、骨髓和淋巴器官或组织等。2抗凝剂的选择 采用肝素钠
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- 临床 免疫学 检验 课件 13 章流式 细胞 分析 技术

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