两水相萃取过程的选择性生物分离工程课件.ppt

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1、两水相萃取过程的选择性,(1) 细胞，细胞碎片影响分配（粘度） 总分配系数(2) 亲和两水相分配(3) 液体离子交换剂,两水相萃取过程的选择性(1) 细胞，细胞碎片影响分配（粘度,两水相体系发展中的问题,相体系回收(1) 环境(2) 成本,两水相体系发展中的问题 相体系回收,成相聚合物的回收,(1) 压力敏感型两水相(2) 热促相分离高聚物EO-PO(3) pH敏感型高聚物（聚两性离子高聚物, 多聚电解质)(4) 光敏感相分离高聚物,成相聚合物的回收(1) 压力敏感型两水相,压力诱导相分离,压力诱导相分离,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,加氨基酸对相图的影响,加氨基酸对相图的影响,

2、加氨基酸对相密度的影响,加氨基酸对相密度的影响,氨基酸的分离配系数,氨基酸的分离配系数,系线长度与分配系数,系线长度与分配系数,热诱导相分离,热诱导相分离,EO-PO-HP-EOPO,EO-PO-HP-EOPO,高聚物结构式,高聚物结构式,相体系回收示意图,相体系回收示意图,相 图,相 图,盐的分配,盐的分配,蛋白纯化,蛋白纯化,EOPO-HPEOPO高聚物回收,EOPO-HPEOPO高聚物回收,H 诱导相分离,H 诱导相分离,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程

3、-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,Recycling Polymers Forming Aqueous Two-phase Systems,Phase separationTop phaseBotto,光敏感聚合物合成,光敏感聚合物合成,Table 1 Probability of PNBC with different components with varied composition to form aqueous two-phase systems,The number 1, 2, 3 denotes the initial

4、 volume ratio 1:1, 2:1, 3:2, respectively. All systems were stood for one day at 20.,Table 1 Probability of PNBC w,Fig 1.Phase diagram for PNBC-Dextran in water solution at 20.,Figure 2. Repeated recovery of polymer in aqueous solution,Figure 3 Recovery comparison of light-sensitive radiation and th

5、ermo-sensitive precipitation of PNBC polymer in two-phase systems. The concentration of salts in total phases was 50mM. The initial volume ratio is 3:2(ml/ml).,Fig 1.Phase diagram for PNBC-D,两水相系统的应用,蛋白质纯化抗生素，氨基酸，天然成分酶相转移催化细胞器分离,两水相系统的应用蛋白质纯化,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生

6、物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,光敏感可再生两水相中青霉素酰化酶催化青霉素G为6-APA,光敏感可再生两水相中青霉素,图 6APA在系列盐系统中的分配系数K,图 6APA在系列盐系统中的分配系数K,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,图6.3 不同系统中PG的酶催化转化率,图6.4 PA浓度变化PG的转化率（未加盐）,图6.5 PA浓度变化PG的转化率（50mM KCl）,配制5%PNBC300000-40%Dextran20000两水相体系45 ml(pH7.8,含0

7、.1M 磷酸盐缓冲液)，上下体积比为8:1，加入固定化酶0.10g（0.2，0.3g）,青霉素G（Na）0.40g,于20振荡反应，每60 min测定6-APA浓度,计算青霉素G转化率。,图6.3 不同系统中PG的酶催化转化率图6.4 PA浓度,重复批转化反应与上述相体系基本相同，只是另加50mM KCl，加入固定化酶0.3g, PG0.18g,(0.4%),在反应360min后,测定上相中6-APA，之后移出上相，加入与原上相相同的组成的上相及PG，重复进行反应，测定6-APA浓度，计算转化率。,重复批转化反应与上述相体系基本相同，只是另加50mM KCl,结 论合成一种对光敏感，可回收再利

8、用的两水相成相聚合物光照回收率均在98以上，热敏回收率在95%以上，可以很好地实现聚合物回收 青霉素G转化率达到79.8%，较单水相提高15%尚需寻找另一种可回收高聚物，使得两水相中两种高聚物都能得到回收。,结 论,全回用两水相体系,意义：1.合成可再生的聚合物。2.构建两水相体系，使两相均能回收3.较好的分离效果。内容：1.以异丙基丙烯酰胺（NIPA）、乙烯基 吡咯烷酮（NVP）、叶绿酸铜钠（CHL）三单体合成可再生光 敏感聚合物PNNC2.PNNC与另一pH敏感聚合物PADB成相3.应用该可再生两水相体系,全回用两水相体系意义：,合成聚合物PNNC示意图,R1：,合成聚合物PNNC示意图R

9、1：,2.聚合物PNNC的合成与表征(1)聚合物PNNC的单体比例选择,选取的单体摩尔比为196：8：1,2.聚合物PNNC的合成与表征聚合物PNNC(NIPA:NV,1.聚合物的成相,通过成相实验和相图，确定使用的两水相体系为 PNNC(10 %) / PADB(5%),成相物质浓度与10%聚合物溶液 成相情况PEG20000,绘制相图,采用 节点检测法,BACK,绘制相图采用 节点检测法 BACK,两水相成相、分相、聚合物回收示意图,两水相成相、分相、聚合物回收示意图,1g聚合物沉淀平均所需要的照射时间为266分钟由公式：Q=W*T 1g聚合物沉淀大概所需要吸收的激光能量为4.8kJ1度电

10、能够使750g聚合物沉淀,2.聚合物PNNC光照回收（1）聚合物PNNC的光照条件 采用激光输出功率为300mw，照射点的面积为1.77*10-6m2,溶液浓度溶液体积1mL0.8mL0.5mL616min15,（2）单水相PNNC溶液光照回收（3）单水相PNNC溶液重复回收实验,96.8,（2）单水相PNNC溶液光照回收组别空白NaClNa2SO4,（4）两水相两聚合物回收实验（5）两水相两聚合物重复回收实验,95.5%,BACK,（4）两水相两聚合物回收实验组别空白NaClNa2SO4Na,3.蛋白质在两水相体系中的分配,（1）盐种类对溶菌酶及牛血清白蛋白（BSA）分配的影响 （均采用20

11、mM无机盐）,3.蛋白质在两水相体系中的分配 （1）盐种类对溶菌酶及牛血清,4.氨基酸的分配实验 (1)盐种类对氨基酸分配的影响 采用色氨酸（Trp），酪氨酸（Tyr）为试样,4.氨基酸的分配实验,1. 通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物PNNC 粘均分子量约为7.1103。2. 选取的成相体系为10（w/w） PNNC与5（w/w） PADB， 成相体积比为1：3。两水相中两聚合物多次光回收和pH回收都在95.5到98.7之间，一定程度上解决了聚合物回收率低的问题。3.以氨基酸、蛋白质等生物物质为研究对象，考察该两水相系统的性质。其中Tyr、Trp的最佳分配系数分别为0.12、 6

12、.25；溶菌酶、BSA的最佳分配系数分别为0.11、4.2。4.该两水相体系对乳酸小分子的分配系数均接近于1，最大分配系数只有2.30。5. 在乳酸的分配模型关联中，朱自强改进的D-H模型 相关性最好，说明在PNNC浓度8.012.0范围内，该模型对乳酸在PNNC/PADB两水相体系中分配系数关联最为准确。,结论,1. 通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物PNNC,H敏感型可回收丙烯酸类两性高聚物的合成及其在两水相中应用,意义：1 构建两种成相聚合物均可回收的新两水相体系 （PNBC/PADB）2 较高的回收率（ 95）3 操作条件相对温和,采用丙烯酸（AA），甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（

13、DMAEMA），甲基丙烯酸丁酯（BMA）,H敏感型可回收丙烯酸类两性高聚物的合成及其在两水相中应用,PADB反应示意图：,通过1H NMR中单体上特征氢，计算得到三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；投料比为19.7：7.24：1,PADB反应示意图：通过1H NMR中单体上特征氢，计算得到,4.聚合物成相实验,选择由pH敏感型聚合物PADB和光敏感聚合物PNBC组成两种成相聚合物均可回收的两水相体系。,4.聚合物成相实验成相物质浓度与5聚合物溶液成相情况5,5.相图,PADB浓度,PNBC浓度,T,B,M,C,选择由10%(w/w)PNBC/5%(w/w)PADB组

14、成两水相体系，,5.相图PADB浓度PNBC浓度TBMC选择由10%(w,2.无机盐种类及浓度对聚合物PADB单水相回收影响,未加无机盐, 2. NaCl；3. KCl；4. Na2SO4 ；5.（NH4）2SO4 ；6. Na3PO4；7. Na4P2O7,2.无机盐种类及浓度对聚合物PADB单水相回收影响未加无机盐,3.单水相聚合物PADB多次循环使用的得率,96.7,98.6,3.单水相聚合物PADB多次循环使用的得率808284868,4.无机盐种类对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响,1. NaCl ；2. KCl ； 3. Na2SO4 ；4.（NH4）2SO4；5. Na3P

15、O4 ；6. NaClO4,98.7,96.8,4.无机盐种类对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响1.,5.无机盐浓度对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响,Na3PO4浓度 (mM),98.6,98.2,5.无机盐浓度对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响909,6.多次回收对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响,97.8,96.7,6.多次回收对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响9091,3. 无机盐种类及浓度对分配系数的影响,27.5,1.没加无机盐；2. NaCl；3. KCl ；4. KBr；5. NaHSO3；6. Na2SO4；7.Na3PO4；8. Na4P2O7

16、,3. 无机盐种类及浓度对分配系数的影响 27.51.没加无机,结 论,1.通过自由基无规聚合，合成了pH敏感型的可回收丙烯酸类两性聚合物PADB ，其粘均分子量约为3.7104，聚合物中三种单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；2.由10（w/w）PNBC /5（w/w）PADB组成两种成相聚合物均可回收的两水相体系，成相体积比为1：2。经过五次循环使用后聚合物PNBC的回收率为97.8；PADB的回收率96.7；3.该两水相体系对大分子有较好的分离效果，其中BSA最大分配系数可达27.5；溶菌酶的最大分配系数可达0.49；,结 论1.通过自由基无规聚合，合成了pH敏感

17、型的可回收丙烯酸,Phase transfer bioconversion of penicillin G into 6-APA by immobilized penicillin acylase in recycling aqueous two-phase systems with light-pH sensitive copolymers,Phase transfer bioconversion o,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic reaction,substrate,product,enzymeenzymeenzymeenzyme

18、enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic reaction with ATPS,enzymeenzymeenzymeEnzymetic re,Relation between 6-APA partition coefficient and inorganic salts,Relation between 6-APA partiti,Partition coefficients change of substrate and products during,Partition coefficients change,Conc. Change of phenyla

19、cetic acid and 6-APA during bioconversios,Conc. Change of 6-APA in top and bottom phase,Conc. Change of Phenylacetic acid in top bottom phase,Conc. Change of phenylacetic a,Total yield of 6-APA in top and bottom phase,Total yield of 6-APA in top a,小 结,1 Immobilized penicillin acylase was used for bi

20、oconversion of penicillin G into 6-APA in ATPS with PNBC and PADB.2 K6-APA 5.78 (containing1% NaCl). Reaction time at 7h or so. The 6-APA mole yields 85.3% (pH 7.8, and 20 ) 3 K 6-APA and K phenylacetate acid was significantly changeable during reaction. 4 PNBCcould be recovered by laser radiation a

21、t 488 nm or filtrated 450 nm light, PADB could be recovered by isoelectric point (pH 4.1) . The recovery of the two copolymers was 96-99%. 5 The bioconversion could be performed at 20 C due PNBC phase separation.,小 结 1 Immobilized penicilli,表面活性剂水胶束两水相体系,概述： 表面活性自组装成分子多聚体（胶束），疏水基向内形成胶 核，亲水基向外，当温度在浊点

22、以上时， 发生分相。与传统两水相的比较： 产生两水相只需要表面活性剂与水 通过控制温度，表面活性剂浓度，盐等可改变胶束大小与形状提供两亲性环境，一般更适合憎水性生物分子通过引进亲和配基或电性基团，增加选择分离效果 通过过滤等手段可方便地将胶束与生物分子分离。,表面活性剂水胶束两水相体系概述：,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,组成两水相的表面活剂,Trixton-X 100, 114CiEOj,组成两水相的表面活剂Trixton-X 100, 114,阴阳离子表面活性剂组成的两水相,概述： 当阴，阳两种离子性表面活剂在临界胶束浓度（CMC）以上混合时形成两水相，上相富含表面活性剂，下

23、相则很少性质：（1）能提供两亲性环境，适合水不溶性蛋白萃取（2）胶束的大小与形状可控（3）胶束表面电荷可控，增加电荷选择性（4）通过稀释或温度变化形成沉淀回收表面活性剂（5）易于操作（低浓度，低粘度，快速分相）,阴阳离子表面活性剂组成的两水相概述：,两水相萃取过程的选择性-生物分离工程-课件,表面活性剂,（1）辛基三甲基溴化铵(OTAB)与辛基硫酸钠(SOS)（2）溴化十二烷基三乙胺(C 12 NE) 十二烷基磺酸钠（SDS）（3）辛基三甲基溴化铵(OTAB) 十或十二烷基磺酸钠（C10S,或 C12S),表面活性剂（1）辛基三甲基溴化铵(OTAB)与辛基硫酸钠(S,思考题,1 两水相萃取应用中最突出的问题是什么？如何解决？2 两水相有几类？如何形成两水相？3 当前两水相体系的回用有哪些方法？其原理是什么?,思考题1 两水相萃取应用中最突出的问题是什么？如何解决？,