TAT凋亡素融合蛋白探讨课件.ppt

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1、TAT凋亡素融合蛋白探讨,2005级生物技术专业尹亚牛81050503,TAT凋亡素融合蛋白探讨,一、引言,肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡平衡失调的结果，肿瘤细胞过少的死亡与过多的增殖均可导致肿瘤过快的生长，进而发展成为癌症。因此，诱导细胞凋亡已成为一种有效的肿瘤治疗途径，在癌症治疗方面也有着诱人的发展前景。,一、引言肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡平衡失调的结果，肿瘤细胞,一般说来p53表达产物促进突变的细胞凋,亡，而bcl-2过表达抑制细胞凋亡大多数肿瘤细胞都存在p53突变和(或)bcl-2过表达，使肿瘤细胞凋亡过程受到抑制 今年来科学家研究发现，鸡贫血病毒vp3基因编码的凋亡素对正常细胞无毒性和转

2、化活性，只选择性地诱导肿瘤细胞凋亡凋亡素促肿瘤细胞凋亡作用不依赖于p53的介导，也不被bcl-2过度表达所抑制 ，有可能成为一种极具潜力的肿瘤抑制剂.,一般说来p53表达产物促进突变的细胞凋 亡，而bcl,二、可引起细胞凋亡的原因,二、可引起细胞凋亡的原因,三、什么是凋亡素,凋亡素（apoptin）是鸡贫血病毒（chicken anemia virus）基因编码产生的一种功能蛋白（分子量13.6kD），将凋亡素基因导入哺乳类动物细胞，可表达凋亡素并选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常的二倍体没有毒性和转化活性，也就是说对正常细胞没有任何影响。,三、什么是凋亡素凋亡素（apoptin）是鸡贫血病毒

3、（ch,四、凋亡素的作用条件,凋亡素只有透过细胞膜进入细胞内，并且进入细胞核与遗传物质相结合才能表现出诱导细胞凋亡的活性，还得有量的积累（但具体积累到多少，浓度达到什么值才起作用目前尚不能确定）。,四、凋亡素的作用条件凋亡素只有透过细胞膜进入细胞内，并且进入,但是细胞膜表面具有多种带负电荷的物质，包括肝素、硫酸乙酰肝素、软骨素硫酸脂等，再加上细胞膜本身的结构特点（磷脂双分子层疏水长链在内亲水磷酸头部在外），阻止像蛋白质这样的极性大分子物质进入，或者是由膜上特殊蛋白介导的具有高度选择性的吸收,但是细胞膜表面具有多种带负电荷的物质，包括肝素、硫酸乙酰,因此由于细胞膜的屏障作用，天然状态存在的凋亡素

4、很难透过细胞膜进入细胞内部诱发细胞的凋亡。而以往是以构建真核表达载体方法，通过非病毒载体转染或者病毒载体感染在细胞内表达并发挥作用，但是这种方法效率不高，因为细胞内不能快速大量的合成凋亡速，而且细胞与细胞之间的凋亡不能相互传递形成连锁反应。,因此由于细胞膜的屏障作用，天然状态存在的凋亡素很难透过细胞,显然，让细胞外大量合成的凋亡素透过细胞膜进入细胞，成为细胞凋亡中的研究热点。近年来陆续发现了几个源自病毒的功能区，能有效地引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白质传送功能，被称为蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)，包括TAT、Antp、VP22等其中TA

5、T是一种源于人类免疫缺陷病毒HIV一1 TAT 蛋白的功能区，其编码序列为YGRKKRRQRRRTAT能将与其融合表达的蛋白质或多肽高效地导人体外培养的细胞，并表现出相应的生物活性,显然，让细胞外大量合成的凋亡素透过细胞膜进入细胞，成为细胞,五、有关TAT,TAT即人类免疫缺陷病毒一（HIV-1）反式激活蛋白，属于蛋白转导结构域（PTD）的一种，今年研究发现：它能将与之连接的多肽、蛋白质以及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率高而对细胞没有损伤，也就是说TAT和其他一些功能蛋白的融合蛋白兼有二者的性质，既能轻易透过生物膜进入细胞又能保持功能蛋白的生物活性。,五、有关TATTAT即

6、人类免疫缺陷病毒一（HIV-1）反式,六、TAT融合蛋白穿膜实例,1、TAT-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性,ET28a 质粒图Fig 1 Map of pET28a Vectors,六、TAT融合蛋白穿膜实例1、TAT-半乳糖苷酶对小鼠生,90 只昆明小白鼠,随机分成3 组。A 组腹注射5mg/ kg TAT-Gal ;B 组注-Gal ;C 组注射生理盐水。分别于腹腔注射30min、1h、2h、4h、8h 断头取脑、肾、肌肉、心肌等组织。快速做冰冻切片,每10m 一片,0.12 %多聚甲醛固定10min ,用含2mmol/ L MgCl2 的PBS 冲洗2 次,在0.11mol/ L pH7

7、.13 PBS、2mmol/ L MgCl2 、0.102 % NP240 、5mmol/ L 铁氰化钾、5mmol/ L 亚铁氰化钾、1mg/mL X2Gal 孵液中, 36 避光染色12h(下页),90 只昆明小白鼠,随机分成3 组。A 组腹注射5mg/ k,用LeicaQ500IW彩色图像分析系统,对不同时间段取材的组织切片观察到的深蓝色细胞即-Gal 阳性细胞,进行光密度测定,以表示TAT 融合蛋白通透的含量。光密度值越大(O1D 值越大) ,表示染色越深,TAT 进入组织细胞的就越多。分析组织内-Gal 含量.见下图：,用LeicaQ500IW彩色图像分析系统,对不同时间段取材的,T

8、AT-Gal 纯化蛋白的SDS2PAGE电泳图,TAT-Gal 纯化蛋白的SDS2PAGE电泳图,经组氨酸亲和层析柱后收集的蛋白洗脱峰只有一条清楚的蛋白带, 经透析复性后, X-Gal 染色10min 溶液变蓝,确认为TAT-Gal ,测蛋白浓度为20g/ L (上页图)，这说明TAT-半乳糖苷酶对小鼠的生物膜具有很强的通透性，可以在短时间内高效有序的进入细胞，但其穿透机理尚不清楚。,经组氨酸亲和层析柱后收集的蛋白洗脱峰只有,X-Gal 染色的脑TAT-Gal 融合蛋白,X-Gal 染色的脑TAT-Gal 融合蛋白,2、TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性,EDAG基因是从人胎肝中分

9、离的具有自主知识产权的新基因，研究表明EDAG（一种功能蛋白）与造血细胞增殖、分化以及凋亡密切相关，EDAG可在体外扩增造血干细胞并维持其未分化状态。构建了TATEDAG融合蛋白原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中实现了融合蛋白的可溶性原核表达。建立一套稳定的融合蛋白纯化体系，并在体外细胞实验中证明了其转导活性。这为下一步应用于体外造血干细胞扩增奠定了基础。,2、TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性EDAG,TAT凋亡素融合蛋白探讨课件,TAT凋亡素融合蛋白探讨课件,结论：,（1）、TAT-EDAG融合蛋白原核表达载体可以实现构建并能很好地翻译出融合蛋白（2）、在大肠杆菌

10、BL21(DE3)细胞中TAT-EDAG融合蛋白原核表达载体实现了融合蛋白的表达（3）、目前已建立一套稳定的融合蛋白纯化体系，目的蛋白的纯度达到90 以上（4）、 TAT-EDAG融合蛋白在体外细胞试验中体现出了较高的转导活性,结论：（1）、TAT-EDAG融合蛋白原核表达载体可以实现构,3、TAT 蛋白转导结构域介导的BCRPABL 融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运,PTD-BCRPABL 融合蛋白在小鼠组织细胞的跨膜转运,3、TAT 蛋白转导结构域介导的BCRPABL 融合蛋白在小,4、TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫目前疟原虫基因功能研究技术，包括基因敲除，基因置换，基因座位置换，外源基因

11、的表达以及最近建立的疟原虫四环素诱导性转基因表达系统等方法都是建立在基因转染技术的基础上 J，而疟原虫基因转染效率的极度低下 成为疟原虫转染尤其是稳定转染研究中一个瓶颈因素，到目前为止这方面研究仍然没有突破性的进展。将TATp53融合蛋白与红内期恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)进行共孵育，观察融合蛋白是否能通过疟原虫的多层细胞膜转导人虫体，以期为疟原虫基因功能的研究引入一种新的技术手段,4、TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫,疟原虫寄生于红细胞内，从外至内共有红细胞膜，含虫空泡膜，疟原虫细胞膜，疟原虫细胞核核膜等4层生物膜，我们即将疟原虫无关蛋白p53与TAT构成

12、融合蛋白，与培养的红内期疟原虫共孵育，观察融合蛋白是否可以转导进入疟原虫内部结果发现TATp53融合蛋白可以转导进入并可以被检测到，而不含有蛋白转导结构域的p53蛋白不能进入表明即使是多层膜含有TAT转导域的多肽或蛋白质仍然可以高效转导进入,疟原虫寄生于红细胞内，从外至内共有红细胞膜，含虫空泡膜，疟原,5、TAT蛋白介导生物活性蛋白到达缺血灶将纯化的TATBGal融合蛋白腹腔注入可复流的MCAO 大鼠，TATBGal融合蛋白迅速被吸收进入血液循环、穿过BBB进入脑组织。实验表明MCAO大鼠缺血2 h再复流后，腹腔注射TATBGal融合蛋白，30 min即可在缺血灶区检测到BGal的活性，4 h

13、达高峰，对于存在治疗时间窗的脑缺血来说十分有利。结论：TAT蛋白能快速、有效地介导生物活性蛋白通过BBB进入神经细胞在脑组织内达到有效浓度而不破坏BBB，为应用蛋白及肽类药物治疗脑缺血再灌注损伤及其他中枢神经系统疾病开辟了广阔前景,5、TAT蛋白介导生物活性蛋白到达缺血灶,PTD2BCRPABL 融合蛋白在HL260 细胞内的分布,PTD-BCRPABL 融合蛋白通过血脑屏障作用,PTD2BCRPABL 融合蛋白在HL260 细胞内的分布,TAT-凋亡素融合蛋白,1、TAT-apoptin表达载体的构建： (1) 借助于质粒载体pET-28a,首先构建pET-28a-TAT载体： 编码链5 端

14、加上Nco工限制酶酶切产生的粘末端CATG，反意链的5端加上BarnH工限制酶酶切产生的粘末端GATC，合成的2条核苷酸链序列如下： 编码链：5 CATG GGC TAT GGT CGT AAG AAA CGC CGC CAA CGT CGG CGT G一3 反意链：5 GATC CAC GCC GAC GrIT GGC GGC GrIfr TCT TAC GAC CAT AGC C一3 将合成的2条单核苷酸链磷酸化后等摩尔混合，加热至95摄氏度，缓慢降温退火，形成双链DNA分子，与经Nco工和BarnH工双酶切的载体pET一28a连接，得到的重组载体命名为pET-28aTAT,TAT-凋亡素

15、融合蛋白1、TAT-apoptin表达载体,（2）进一步在pET-28a-TAT的质粒载体上加入apoptin编码基因：从质粒pEGFPC1一apoptin中经PCR扩增出凋亡素编码基因上游引物为：5 -CGTAGGATCC ATGAAC GCT CTC CAA GAA G-3 ，下游引物为：5 一GTCAGCTCGAG TCT TAT ACG CCT TTT TGC一3 上游引物的5 端加上限制性内切酶BarnHI的识别序列GGATCC，下游引物的5 端加上限制性内切酶Xho工的识别序列CTCGAGPCR产物经12琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，再甩BarnH工和Xho工双酶切，与经过相同双酶切的

16、载体pET28aTAT连接，得到的重组载体命名为pET-28a-TAT-apoptin,（2）进一步在pET-28a-TAT的质粒载体上加入,TAT凋亡素融合蛋白探讨课件,2、 pET-28a-TAT-apoptin的表达,将pET-28a-TAT-apoptin重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中，挑取单菌落接种至含卡那霉素(50 gIll1)的Terrific Broth(TB)培养基中，37 cI=振荡培养过夜，次日以1：50的比例接种至含卡那霉素(50gm1)的TB培养基中，37振荡培养至A鲫达到06时，加入终浓度为05 mmolL IPTG，继续培养6 h，以5

17、 000 dmin离心10 min收集菌体,2、 pET-28a-TAT-apoptin的表达将pET-,3、TAT-凋亡素融合蛋白对肿瘤细胞的作用,3、TAT-凋亡素融合蛋白对肿瘤细胞的作用,TAT凋亡素融合蛋白探讨课件,DAB显色后，凋亡细胞胞核呈棕褐色着染,DAB显色后，凋亡细胞胞核呈棕褐色着染,TAT-凋亡素融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制,53的表达产物可以促进突变的细胞凋亡，一般的细胞凋亡是通过诱导p53过表达实现的，而科学研究表明TAT-apoptin诱导细胞凋亡不收p53过表达影响。bcl-2过表达抑制细胞凋亡，但在肿瘤细胞内，bcl-2的过表达不仅不会抑制TAT-apopt

18、in 对细胞的凋亡作用，反而能够促进TAT-apoptin的作用,TAT-凋亡素融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制p53的表达,科学家对凋亡机制作了很多猜测，但目前还没有那一种能让世人普遍接受。可以肯定的是：凋亡素进入细胞核大量积累，并且以2040的多聚复合体凝聚在染色体上，导致DNA不能正常复制，大多试验中，肿瘤细胞凋亡首先是从核的裂解开始，然后整个细胞破裂降解。Rohn 等研究表明:在体内外肿瘤细胞中凋亡素蛋白分子在108 位苏氨酸位点磷酸化,而在正常细胞中不存在此现象。T108E 功能获得性点突变赋予了Apoptin 核聚集和杀伤正常细胞的能力,这意味着磷酸化是凋亡素肿瘤特异性的关键调节

19、因素,科学家对凋亡机制作了很多猜测，但目前,TAT-apoptin融合蛋白的穿膜机制,目前尚无定论，存在几种假设，一般认TAT和其他蛋白的融合蛋白穿膜应该具有相同的机制。试验表明：TAT-X融合蛋白穿膜于能量无关、于温度无关（有少数试验中低温也能抑制它穿膜），不可能是细胞内吞作用，也不可能是由特异受体所介导的，也不是反胶束作用（反胶束的形成需要疏水氨基酸的存在）。通过对TAT-PTD序列的测定发现碱性氨基酸（Lys,Arg）在跨膜运输中起重大作用，并且不收其旋光异构体的限制，带正电荷的氨基酸对跨膜运输同样具有重要的作用，为此研究者提出了一种模型：,TAT-apoptin融合蛋白的穿膜机制目前尚无定论，存在几,TAT凋亡素融合蛋白探讨课件,小结,跨膜转运机制、诱导凋亡机制、凋亡素在细胞核内积累量于诱导凋亡的关系，TAT-apoptin融合蛋白在诱导肿瘤细胞凋亡的同时会不会对人体有什么副作用、正常细胞是否具有阻断apoptin细胞核定位信号的因子（或者肿瘤细胞具有激活apoptin核输入通路）、apoptin能否成为癌症特异的诊断与治疗工具这些问题均有待于进一步解决。,小结跨膜转运机制、诱导凋亡机制、凋亡素在细胞核内积累量于诱导,The end,Thanks,The endThanks,