MS基础知识解析课件.ppt

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1、质谱知识,丁俊杰 Friday, November 4, 2022,质谱知识,质谱分析法是通过测定被测样品离子的质荷比来对被测物进行定性定量分析的一种方法。,1906年，JJThomson “Father of mass spectrometry”,质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法, 而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。,发展,质谱分析法是通过测定被测样品离子的质荷比来对被测物进行定性定,历史1906年 J.Jthomson于1912年制造出第一台质谱仪1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer)1953-1958年 出现四极杆质量

2、分析器(Quadrupole)1956年 GC-MS开始联用1959年 质谱首次用于肽序测定1965年 离子共振质谱出现1968年 电喷雾离子源1973年 LC-MS1974年 Fourier transform ion cyclotor resonance MS1987-1988年 Matrise assisted laser desorption ionization1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究,历史,Nobel Prize in MS,Nobel Prize in MS,LC-MS 检测,回答分析化学中最常见的问题定性 - 样品中有什么?定量- 样品中有多少?,LC-

3、MS 检测回答分析化学中最常见的问题,药物色谱分析中不同方法的比例,1990 年 2000 年,数据来源：American Society for Mass Spectrometry, 2002,药物色谱分析中不同方法的比例1990 年,分类,Orbitrap:实现离子分离、裂解和多级质谱MSn功能，提供精确的质量分析和高分辨率检测SYNAPT:系统将UPLC分离、高效离子淌度（IMS）和正交飞行时间质谱融合,MSOMSGC-MSLC-MSQuadrupoleSSQTS,LC-MS联用系统的组成,由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空

4、。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。,LC-MS联用系统的组成由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵,离子源,电子轰击源（Electro-Impact source, EI）化学电离源（Chemical Ionization, CI）场致电离源（Field Ionization, FI）场解吸电离源（Field Desorption, FD）快原子轰击（Fast atom bombardment, FAB） 液相色谱质谱联机的接口大气压电离源（Atmospheric Pressure Ionization, API）电喷雾电离（Electro Spary I

5、onization, ESI）& nano-ESI大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI）大气压光喷雾电离(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization, APPI）基质辅助激光解析电离（matrix-assisted laser desorption-ionization, MALDI）,离子源电子轰击源（Electro-Impact source,分子量,非极性,极性,EI/CI,ESI,APCI,100,000,1000,哪种离子化方式?,APPI,MALDI,分子量非极性极性E

6、I/CIESIAPCI100,000100,质量分析器,扇形磁场分析器 (Sector Magnetic )四级杆分析器（quadrupole）离子阱(ion trap, IT)飞行时间质量分析器（Time of flight, TOF）傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform-ion cyclotron resonance, FT-ICR),质量分析器扇形磁场分析器 (Sector Magnetic,质量分析器比较,种类检测参数质量范围(Da)质量精度真空优点缺点扇形磁场动量,MS Family,进样系统,离子源,质量分析器,MALDIESI,TOFIon Trap (IT

7、)Quadrupoles (Q)FTMS,MALDI-TOF; MALDI-TOF/TOFESI-TOFESI-Qq-TOFESI-Ion TrapESI (or MALDI or .) FTMSESI (or MALDI or .) Q-q FTMSESI-triple Quadrupoles,Many other hybrid configurations,不同类型,GCHPLCUPLC,杂化的分析器(hybrid MS) quadrupole + TOF（Q-TOF） TOF+TOF (TOF/TOF) quadrupole + ion trap（Q-trap） (Orbitrap),M

8、S Family进样系统离子源质量分析器MALDITOFM,Suppliers of LC-MS,Thermo-Fisher (USA) AB (USA) （被Invitrogen 收购）Bruker Daltonics (Germany) Waters (USA) Varian (USA) Agilent (USA) Shimadzu (JAPAN) ,Suppliers of LC-MSThermo-Fishe,我们接触的质谱,UPLC-MS/MS：AB2000 Quattro micro, 三重四级杆质谱仪LC-IT/MS： Thermo LCQ Fleet, 离子阱质谱仪,离子源,电喷

9、雾电离源 Electrospray Ionization (ESI)大气压化学电离源 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI),我们接触的质谱UPLC-MS/MS：AB2000 Quatt,两种离子源的比较,两种离子源的比较种类ESIAPCI电离机理离子蒸发高压放电发,接触的质谱LC-MS,LC-MS：四级杆质谱仪,SIM fixed,Full scan scan,接触的质谱LC-MSLC-MS：四级杆质谱仪SIM,MS基础知识解析课件,LC-MS注意事项,扫描分子量 首先一定要确保所要扫描物质的纯度(98%)，然后用合适的溶剂(MeOH,

10、 ACN, H2O)使浓度范围在5-20g/mL。高速离心转移后便可以扫描 。 （尽量不用DMF&DMSO&吡啶&丙酮）扫描时正负离子均要扫描，以便于解析结果，扫描范围要达到预计分子量的3倍纯度足够的话是不用加色谱柱的，如果不够可以连色谱柱做全扫描,Full scan,LC-MS注意事项扫描分子量Full scan,常见的准分子离子峰,(甲醇32, 乙腈41 ,甲酸46,乙酸60),常见的准分子离子峰正离子模式检测负离子模式检测M + H,一些有用的规律,(甲醇32, 乙腈41 ,甲酸46, 乙酸60),一些有用的规律正离子模式检测M + H+=M + 1M,M+H+,129.1,加合离子的质

11、谱图举例(+),MW 128,M+NH4+,MW 275,M+H+,221.1,MW 220,M+Na+,2M+H+,2M+Na+,2M+NH4+,M+H+129.1 + c Full ms 240.,(E) Doubly charged ion: M+2H2+,(MW 698),正离子检测方式,(E) Doubly charged ion: M+2H,695.2,MW 224,+ c Full ms 50.00-1000.002,M H ,MW 222,负离子检测方式,2M H ,MW 230,天麻素(MW 286),MH ,M H - c Full ms 50.00-,天麻素的一级负离子扫

12、描图,M=286M-H= 285M-H+H2O= 303 ?M+Cl= 321M-H+HCOOH= 331,天麻素的一级负离子扫描图M=286,（1）选择离子监测（SIM） SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。 若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。,（1）选择离子监测（SIM）,和液相的比较,SIM fixed,LC/PDA = 254 nmLC/MS = 228 m/z,接触的质谱LC-MS/MS,UPLC-MS/MS：AB Quattro micro，三重

13、四级杆质谱仪,CID：collision-induced dissociation,接触的质谱LC-MS/MSUPLC-MS/MS：AB Qua,接触的质谱LC-MS/MS-三重四极杆工作模式,接触的质谱LC-MS/MS-三重四极杆工作模式模式Q1Q2Q,（3）多反应监测Multiple Reaction Monitoring (MRM),母离子和子离子均选定，定量专用,（3）多反应监测Multiple Reaction Moni,母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。,（4）母离子扫

14、描PAR Scan,母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子,（5）子离子扫描DAU Scan,选定一个母离子对这个母体产生的所有碎片信息进行记录。这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。,（5）子离子扫描DAU Scan 选定一个母离子对这个母体产,中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断。,(6)中性丢失扫描CNL Scan,中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿,注意事项,1.定量都是用MRM模式要注意两个关键参数毛细管电压和裂解电压,2.定性会用到所有的功能仍然要注意裂解

15、电压，如果做代谢的话有用到很多常量参数,注意事项1.定量都是用MRM模式2.定性会用到所有的功能,接触的质谱LC-IT/MS,LC-IT/MS：Thermo LCQ Fleet LC/MS，是美国Thermo公司产品，离子阱质谱仪,SIR,MRM,MS(n),Auto MS(n),接触的质谱LC-IT/MSLC-IT/MS：Thermo L,离子阱的信号衰减，一般做到4-5级,1/3 cut-off of mass-to-charge ratio,接触的质谱LC-IT/MS,离子阱的信号衰减，一般做到4-5级1/3 cut-off o,如何选择,如何选择LC-MSLC-MS/MSLC-IT/M

16、SLC-Q/,分析条件的移植,1.接口的选择： ESI APCI,2.正、负离子模式的选择：,正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。,分析条件的移植1.接口的选择：2.正、负离子模式的选择：正离,3.流动相的选择,常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物LC-MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液 甲酸（乙酸） 0.2 三氟乙酸 0.1。 含三乙胺 l。 醋酸铵 5-10 mmoL/L,4.流量和色谱

17、柱的选择,ESI的最佳流速0.2-0.3 mL/min 应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流目前大多采用 1-2.1 mm内径的微柱APCI的最佳流速0.8-1 mL/min，常规的直径4.6mm柱最合适,3.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的,样品的预处理常用方法,a）超滤b）溶剂萃取/去盐c）固相萃取d）甲醇或乙腈沉淀蛋白e）酸水解，酶解f）衍生化,分析条件的移植,样品的预处理常用方法a）超滤分析条件的移植,基质效应 matrix effect,离子抑制原因：生物样品中内源性物质影响分析物离子化后果：使信号强度下降，甚至消失发现： 配制生物样品，与溶液样品对比解决

18、方法：改进样品预处理方法；色谱分离,基质效应 matrix effect离子抑制,LC-MS中常见的本底离子,m/z 50-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子m/z 391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C2

19、4H38O4H+, 391.2843m/z 413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管) , Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793,LC-MS中常见的本底离子m/z 50-150, 溶剂离子，,MS 的限制,样品必须离子化离子能够运行、控制和质量分析必须有足够的真空度离子飞行轨迹的路径必须绝对重视真空越高越好必须能够测量离子的质量准确的质量/电荷数比（m/z）,MS 的限制样品必须离子化,问 题,一般的加合离子都是从哪来的？会出现M+H2O+H+有这个加合峰吗？在多级图谱中会出现S+Na+加合峰吗？一级质谱也会产生碎片离子吗？子离子m/z一定比母离子m/z小吗？三维离子阱和线性离子阱有什么区别？ 为什么用LC-MS/MS定量比LC-MS定量更灵敏？ 为什么气质有谱库而液质没有谱库,问 题一般的加合离子都是从哪来的？会出现M+H2O+H+,谢 谢!,谢 谢!,