L5-三章测序与合成课件.ppt

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1、第三章 核酸分析与合成第一节 核酸序列分析,1975年，Sanger加减法Maxam-Gilbert化学法1978年， Sanger末端终止法， 1958 胰岛素顺序+1980 测序一、加减法1、原理*0-系统:不等长度片段*加法：T4 DNA Polymerase+1dNTP(35外切 5 3聚合）*减法：DNA PolymeraseI +3dNTP2、应用举例0-系统的产生加法系统与减法系统,第三章 核酸分析与合成第一节 核酸序列分析,0系统的产生,0系统的产生,0系统 +A +G +C +T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG-TACGAC -TACGA

2、C -TACGAC -TACGAC -TACGAC-TACGA -TACGA -TACGA -TACGA -TACGA-TACG -TACG -TACG -TACG -TACG-TAC -TAC -TAC -TAC -TAC-TA -TA -TA -TA -TA-T -T -T -T -T 2种片段 1种片段 2种片段 1种片段 下划线为切去的碱基,加法系统,0系统 +A,0系统 -A -G -C -T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG-TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGAC-TACGA -TACGAC -TACGAC

3、-TACGA -TACGAC-TACG -TACG -TACGAC -TACGA -TACGAC-TAC -TACG -TAC -TACGA -TACGAC-TA -TACG -TAC -TA -TACGAC-T -T -TAC -TA -TACGAC 3种片段 2种片段 3种片段 1种片段下划线为加上的碱基,减法系统,0系统 -A,5标记后电泳、放射自显影：读序与模板的关系、加减系统存在的必要、0系统存在的必要,5标记后电泳、放射自显影：读序与模板的关系、加减系统存在,二、特异化学试剂裂解法,1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯键不稳定而水解2、特异化学试剂裂解嘌呤-硫酸二甲酯 嘧啶-肼和

4、呱啶*裂解G和A的反应（GA）*强化A的裂解（AG）*裂解C和T的反应*裂解C的反应举例,二、特异化学试剂裂解法1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯,5*pGTACGA AG C+T C5*pG 5*pG 5*pGT ll5*pGTA 5*pGTA 5*pGTAC 5*pGTAC GA AG C+T C C A T G 5,C 3,三、末端终止法,DNA聚合酶I及 2, 3-双脱氧核苷酸（ddNTP）1、原理（genetic-rec-seq）2、单链的产生：M133、停止与压缩反应停止-M13的二级结构，阻止延伸-提高温度压缩-由于产物的二级结构，多条条带走到一起-改变变性胶条件4、测序自动

5、化,三、末端终止法DNA聚合酶I及 2, 3-双脱氧核苷酸（,3 GTAGCAACT 5 d(ACG)TP+dTTP+ddTTP d(ACT)TP+dGTP+ddGTP d(AGT)TP+dCTP+ddCTP d (GCT)TP+dATP+ddATP T组 G组 C组 A组3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT5 CAddT* 5 CATCddG* 5 CATddC* 5 CddA* CATCGddT* CATCGTTddG* ddC* CATCGTTGddA* CATCGTddT*,AGTTGCTAC,电泳方向,DNA测序中作链终止剂的

6、核苷类似物,2, 3-双脱氧核糖核苷5-三磷酸,DNA测序中作链终止剂的核苷类似物 2, 3-双脱氧核,L5-三章测序与合成课件,复习提纲,1、加减法DNA测序的原理及其实例。2、特异化学试剂裂解法进行DNA测序的原理和实例。3、末端终止法进行DNA测序的原理和实例。4、什么是停止与压缩反应？,复习提纲1、加减法DNA测序的原理及其实例。,第二节 基因的化学合成及诱变,1955 Todd 二核苷一磷酸磷酸二酯-磷酸三酯-亚磷酸三酯液相-固相-自动化1981 有活性tRNAAla-上海生化所-世界上第一个具有全部生物活性的人工核酸分子 一、化学合成法1、保护基及其去除,第二节 基因的化学合成及诱

7、变1955 Todd 二核苷一磷酸,核糖-OH、P、碱基的NH2 对保护基的要求：无付反应、稳定、易脱、脱保时链完整2、缩合剂磷酸酯键的形成（脱水反应、有机溶剂进行）双环己基碳二亚胺 DCC三甲基苯磺酰氯 MS3、合成方法（1）磷酸二酯法付产物多、产率低、操作复杂,核糖-OH、P、碱基的NH2,保护的基团保护基的分子式缩写符号保护基的去除方法末端磷酸基-,(2)磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快(3)亚磷酸三酯法反应速度快、可固相合成原理：*末端核苷（3的第一个碱基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠）*循环反应

8、*洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度,L5-三章测序与合成课件,L5-三章测序与合成课件,4、合成寡核苷酸纯化方法*脱盐：（乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18）纯度低*OPC柱纯化：（DMT）有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于40mer的oligo*HPLC纯化：吸附于反相柱的差异、用于PCR反应；基因合成和DNA序列分析（较纯，40mer、Grich不适用、设备要求高）*PAGE纯化：可用于任何反应（最纯、无限制、但费事、有毒）二、寡核苷酸化学合成的实际用途（1）基因合成的元件（2）核苷酸序列分析的引物（3）核酸分子杂交的探针（4）突变研究,4、合成寡核苷酸纯化方法,

9、L5-三章测序与合成课件,三、基因突变1、寡核苷酸诱发基因定点突变（1）原理突变的寡核苷酸为引物合成DNA-复制-突变（2）寡核苷酸诱发定点突变过程M13正链DNA与突变引物结合-延伸制备异源双链DNA分子-异源双链DNA分子的富集（S1核酸酶、碱性蔗糖密度梯度离心）-转化-筛选（序列分析、限制酶切、杂交、生物学）突变位点保护：错配碱基外有一个以上碱基,三、基因突变,L5-三章测序与合成课件,2、缺失突变（1）特定位点*酶切（只产生一个酶切位点）*缺失突变探针（2）随机位点*DNaseI-在双链产生单链缺口-缺口扩大-S1平端化-重新环化=一组缺失突变体3、插入突变（1）位点特异性插入（利用限

10、制酶位点）（2）随机插入（利用化学合成的接头）,2、缺失突变,L5-三章测序与合成课件,/-AAGCTT-GAATTC-/ EcoRI /-AAGCTT-G AATTC-/ Pol/-TTCGAA-CTTAAG-/ /-TTCGAA-CTTAA G-/-AAGCTT-GAATTAATTC-/-TTCGAA-CTTAATTAAG-/,/-AAGCTT-GAATTC-/ EcoRI,L5-三章测序与合成课件,4、盒式突变(cassette mutagenesis)原理：通过一次寡核苷酸的合成，在一段DNA区域内（20-80nt）产生众多的突变在预定位点，除正常核苷酸外，以10%添加另三种核苷酸一组兼并寡核苷酸,ATAGTCCCA,4、盒式突变(cassette mutagenesis)AT,复习提纲,5、化学法合成核酸时，哪些基团需要保护？对保护基的要求是什么？6、核酸的化学合成都有哪些方法？现在常用的是哪种？其原理和过程是什么？7、合成寡核苷酸纯化方法有哪些？各有怎样的应用范围和局限？8、寡核苷酸化学合成的实际用途？9、寡核苷酸诱发基因定点突变的原理和过程。10、如何诱发缺失突变？如何诱发插入突变？11、什么是盒式突变？其原理是什么？,复习提纲5、化学法合成核酸时，哪些基团需要保护？对保护基的要,