KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件.ppt

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1、KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件,任务6 食品中蛋白质和氨基酸的测定,6.1 蛋白质测定的基本原理,蛋白质的化学组成 蛋白质是以为氨基酸为基本单位、复杂的含氮生物大分子，主要元素组成()为：C（5055）；H（68）；O（2030）；N（1518）；S（04）。另外，还有P、Fe、Zn、Cu、l等元素。,项目四 食品中营养成分检验技术,任务6 食品中蛋白质和氨基酸的测定6.1 蛋白质测定的基,氨基酸的特点,氨基酸的存在形式 组成蛋白质氨基酸有20多种氨基酸。非蛋白氨基酸 已发现有150多种，存在于各种细胞组织中，呈游离状态或结合状态，其氮为非蛋白氮。,氨基酸的特点氨基酸的存在形式,蛋白质系数

2、 不同蛋白质其氨基酸组成的比例不同，所以不同的蛋白质，其含氮量也不同。一般含氮量为16 ，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，称之为蛋白质系数。,蛋白质系数,蛋白质测定的基本原理利用蛋白质的共性，即含氮量，肽键和折射率的性质利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团的性质。,蛋白质测定的基,6.2 蛋白质测定的方法,凯氏定氮法,双缩脲法（快速法）,水杨酸比色法（快速法）,染料结合法,酸试剂法,红外分析仪,6.2 蛋白质测定的方法凯氏定氮法双缩脲法（快速法）水杨, 常量凯氏定氮法,原理,6.2.1 凯氏定氮法, 常量凯氏定氮法 原理6.2.1 凯氏定氮法,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定

3、课件,适用范围 适用于各类食品中蛋白质含量的测定。试剂 浓H2SO4 CuSO4 K2SO4 40 % NaOH 4 % H3BO3 0.1 M HCl 甲基红溴甲酚绿指示剂,适用范围,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件, 微量凯氏定氮法,原理 同常量凯氏定氮法。主要仪器 凯氏烧瓶（100 ml）；微量凯氏定氮装置。试剂 0.0100 mol/L HCl标液；其他同常量凯氏定氮法。操作方法 略, 微量凯氏定氮法,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件,6.2.2 双缩脲法,原理 蛋白质分子中含有肽键（-CO-NH-），与双缩脲结构相似，呈现双缩脲反应。在一定条件

4、下其颜色深浅（吸收波长560 nm）与蛋白质含量成正比。适用范围与特点 适用范围：豆类，油料，米谷等作物种子及肉类。 特点：灵敏度较低，但操作简单。主要仪器 分光光度计 离心机（4000 r / min）,6.2.2 双缩脲法原理,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件,6.2.3 水杨酸比色法,原理 蛋白质 硫酸消化 铵盐溶液NaClO 一定酸度和温度 蓝色化合物（可在660 nm进行比色）。,主要仪器 分光光度 恒温水浴箱,6.2.3 水杨酸比色法 原理 主要仪器,试剂 氮标准液：(NH4)2SO4 100 2 h 称取0.4719 g 小烧杯 移入100 ml容量瓶 定容 摇匀 10 mgN

5、 / ml 稀释成2.50 g / ml,试剂,6.2.4 紫外分光光度计,原理 蛋白质及其降解产物的芳香环残基(-NH-CR-CO-)，在紫外区内对一定波长(280 nm)的光具有选择吸收作用，在此波长下，光吸收程度与蛋白质浓度(3 - 8 mg / ml)成直线关系。,6.2.4 紫外分光光度计,6.3 氨基酸总量的测定（氨基态氮的测定）,茚三酮比色法,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,6.3 氨基酸总量的测定（氨基态氮的测定）茚三酮比色法双指示,6.3.1 双指示剂甲醛滴定法,原 理 氨基酸含有酸性的-COOH，也含有碱性的-NH2，它们互相作用使氨基酸成为中性内盐，不能直接用碱液滴定它的

6、羧基，当加入甲醛时，-NH2与甲醛结合，起碱性消失，使-COOH基显示出酸性，可用NaOH标液滴定。,6.3.1 双指示剂甲醛滴定法,操作方法 1.样品(氨基酸20 mg) 250 ml三角烧瓶 加入50 ml水，3滴0.1 中性红 摇匀 0.05 mol / L NaOH滴定至琥珀色。 2.样品(氨基酸20 mg) 250 ml三角烧瓶 加入50 ml水，3滴0.1百里酚酞，20 中性甲醛 摇匀，静置1 min 0.05 mol/L NaOH滴定至淡蓝色。,操作方法,KJ01-蛋白质和氨基酸的测定课件,6.3.2 电位滴定法,原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出

7、酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH标液滴定，依据酸度计指示的pH值判断终点。,6.3.2 电位滴定法,6.3.3 茚三酮比色法,6.3.3 茚三酮比色法,实训（一）食品中蛋白质含量测定 凯氏定氮法,一、实训目的,1学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。2掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。,实训（一）食品中蛋白质含量测定一、实训目的1学习凯氏定氮法,二、实训原理,蛋白质是含氮的化合物。样品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水溢出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化

8、液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。,二、实训原理 蛋白质是含氮的化合物。样品与浓硫酸和催化,三、仪器与试剂,1仪器 定氮仪；凯氏烧瓶；消化炉。2试剂（1）硫酸铜（CuSO45H20）（2）硫酸钾；（3）硫酸（密度为1.8419g/L）；（4）硼酸溶液（20g/L）；（5）氢氧化钠溶液（400g/L）；（6）0.01mol/L 盐酸标准滴定溶液；（7）混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份,临用时混合；（8）黄豆粉。,三、仪器与试剂1仪器,四、操作流程,样品消化 样品蒸馏 硼酸吸收

9、 滴定 结果分析,四、操作流程,五、操作要点,1样品消化 称取黄豆粉约0.3g（0.001g），移入干燥的100mL 凯氏烧瓶中，加入0.2g 硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL 浓硫酸，将瓶以450 角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL 水，放冷后，无损地转移到100mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。,五、操作要点1样品消化,3碱化蒸馏 量取硼酸试剂20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂23

10、滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a 关闭，螺旋夹b 开启的状态下，准确吸取10.0mL 样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。,3碱化蒸馏,4样品滴定 以0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。 同时吸取10.0mL 试剂空白消化液按上法蒸馏操作，

11、得滴定空白液。,4样品滴定,六、结果与分析,1数据记录于下表。 数据记录表,六、结果与分析1数据记录于下表。项目第一次第二次第三次样品,2计算 按下式计算每百克样品蛋白质含量，结果保留三位有效数字。式中 X样品蛋白质含量，g/100g； V1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积，mL； V2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积，mL； c盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L； 0.0140 1.0mL 盐酸c= 1.000mol / L标 液相当的氮的质 量，g； m样品的质量，g； F氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及

12、其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。,2计算,七、注意事项与说明,1本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.00g5.00g；液体样品取样10.0mL25.0mL（约相当氮30mg40mg）。检测液体样品，结果以g/100mL表示。2消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。3消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入30过氧化氢

13、23mL，再加热消化至完全。,七、注意事项与说明1本法也适用于半固体试样以及液体样品检测,4硼酸吸收液的温度不应超过40，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。5在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,4硼酸吸收液的温度不应超过40，否则氨吸收减弱，造成检测,八、思考与讨论,1、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？2、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？3、实

14、验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？,八、思考与讨论1、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测,实训（二）电位滴定法测定食品中氨基酸总量,一、实训目的,学习电位滴定法测定食品中氨基酸总量的基本原理和操作方法。,实训（二）电位滴定法测定食品中氨基酸总量一、实训目的,二、实训原理,利用氨基酸两性电解质作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计控制测定终点。,二、实训原理 利用氨基酸两性电解质作用，加入甲醛以固定,三、仪器与试剂,1仪器 酸度计；磁力搅拌器；10mL 微量滴定管。2试剂及材料（1）36%甲醛：应不含有聚合物。（2）0.050mol/L

15、 氢氧化钠标准溶液。（3）酱油。,三、仪器与试剂1仪器,四、操作流程,样品处理 总酸含量滴定 氨基酸态氮含量滴定 空白滴定 结果分析,四、操作流程,五、操作要点,1样品处理吸取酱油5.0mL，加水稀释并定容至100mL。2样品测定（1）吸取20.0mL 试样，置于200mL 烧杯中，加60mL 蒸馏水，开动磁力搅拌器，待搅拌稳定后把酸度计的复合电极小心放入烧杯的合适位置，用氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，按总算计算公式，可计算总酸含量。,五、操作要点1样品处理,（2）准确加入10.00mL 甲醛溶液，混匀，再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH

16、9.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，供计算氨基酸态氮含量用。（3）同时量取80mL 水，先用0.05mol/L 氢氧化钠溶液调节至pH 为8.2（记录用去氢氧化钠标准溶液的体积，此为测总酸的试剂空白试验），再加入10.00mL 甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至9.2，第二次所用氢氧化钠标准溶液体积为测定氨基酸态氮的试剂空白对照。,（2）准确加入10.00mL 甲醛溶液，混匀，再用氢氧化钠标,六、结果与分析,1数据记录于下表。 数据记录表,六、结果与分析1数据记录于下表。项目第一次第二次第三次平均,2计算 按下式计算每百毫升样品中氨基酸态氮含量，结果保留两位有效数字。式中 X样品

17、中氨基酸态氮的含量，g/100mL； V1测定样品在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； 0.014 与1.00mL 氢氧化钠标准滴定溶液c(NaOH)=1.000mol/L 相当的氮的质量，g；,2计算,七、注意事项与说明,1本法具有准确快速的特点，可用于各类食品游离氨基酸含量测定。2对固体样品一般应进行粉碎，准确称样后加适量水在50水浴中萃取0.5h，再进行检测。3酱油中的铵盐影响氨基酸态氮的测定，可使氨基酸态氮测定结果偏高。因此要同时测定铵盐，将氨基酸态氮的结果减去铵盐的结果比较准确。,七、注意事项与说明1本法具有准确快速的特点，可用于各类食品,4对于混浊和色深样品可不经处理而直接测定。5检测结果的准确性与所使用的酸度计是否准确密切相关。因此在检测前应检查复合电极的可靠性，用电极标准缓冲对酸度计进行校正，使用完毕需用蒸馏水冲洗电极，浸泡在饱和KCl 溶液的保存。检测用酸度计数度要求为0.01pH。,4对于混浊和色深样品可不经处理而直接测定。,八、思考与讨论,1检测时为什么要加入甲醛？选用何种玻璃仪器加量甲醛？2根据实验结果，探讨产生实验误差的因素。,八、思考与讨论1检测时为什么要加入甲醛？选用何种玻璃仪器加,