蛋白质检测方法.docx

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1、蛋白质的检测（参考GBT643294）一、原理凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物,使含氮物转化为硫酸镀。加入强碱进行蒸馈使氮溢出，再用酸滴定,测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25,计算出粗蛋白含量。二、试剂（1）硫酸化学纯，含量为98%,无氮；（2）混合催化剂0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀；（3）氢氧化钠化学纯，40%水溶液（m/V）；（4）硼酸化学纯，2%水溶液（m/V）；（5）混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，澳甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月；（6）盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定；

2、a） 0.1moll盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入IOOOmL蒸储水中。b） 0.02moll盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入IOOOmL蒸储水中。（7）蔗糖分析纯；（8）硫酸筱分析纯，干燥；（9）硼酸汲取液1%硼酸水溶液IOOOmL,加入0.1%溟甲酚绿乙醇溶液IOmL,0.1%甲基红乙醇溶液7mL,4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。三、仪器设施（1）试验室用样品粉碎机或研钵；（2）分样筛孔径0.45mm（40目）；（3）分析天平感重0.0001g；（4）消煮炉或电炉；（5）滴定管酸式，10、25mL；（6）凯氏烧瓶250mL；（7）凯氏蒸储装置常量直接蒸

3、播式或半微量水蒸气蒸储式；（8）锥形瓶150、250mL；（9） 容量瓶100mL；（10）消煮管250mL；（Il）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。四、分析步骤（一）仲裁法1 .试样的消煮称取试样0.5Lg（含氮量5-8Omg）（精确至0.0002g）,放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合匀称，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开头小火，待样品焦化、泡沫消逝后，再加强活力（360-410C）直至呈透亮的蓝绿色，然后再连续加热，消化全过程至少2ho2 .氨的蒸储（1）常量蒸播法将试样消煮液冷却，加入60-10OmL蒸储水，摇匀，冷却

4、。将蒸储装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸汲取液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后当心地向凯式烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯式烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸储，直至流出液体体积为IoOmL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，连续蒸储l-2min,并用蒸储水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸播。（2）半微量蒸播法将试样消煮液冷却，加入20mL蒸储水，转入IOOmL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸储装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸汲取液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，在蒸储过程中保持此液为橙红色，否则需补充

5、硫酸。精确移取试样分解液10-20mL注入蒸储装置的反应室中，用少量蒸储水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加IOmL氢氧化钠溶液，当心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸储4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开汲取液面，再蒸储Imin,用蒸僧水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸播。注：两种蒸播法测定结果相近，可任选一种。（3）蒸播步骤的检验精确称取0.2g硫酸筱，代替试样，选仲裁法或推举法“氨的蒸储”中的步骤进行操作，测得硫酸镀含量为21.19%0.2%,否则应检查加碱、蒸播和滴定各步骤是否正确。（二）推举法1 .试样的消煮称取05-lg试样（含氮量

6、5-8Omg）（精确至0.0002g）,加入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂，与420C下在消煮炉上消化lh。取出冷却后加入30mL蒸储水。2 .氨的蒸播采纳全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。采纳半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸储装置上，以25mL硼酸为汲取液，加入2滴混合指示剂，蒸馈装置的冷凝管末端要浸入装有汲取液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸储。蒸储时间以汲取液体积达到IOOmL为宜。降下锥形瓶，用蒸储水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内。3 .滴定用0.1molL的盐酸标准溶液滴定汲取液,溶液由蓝色变成红色为终点。五、空白测

7、定称取蔗糖05g,代替试样，进行空白测定，消耗0.1molL盐酸溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02molL盐酸标准溶液体积不得超过OJmL0六、分析结果的计算和表述计算见下式：粗蛋白质=（V2-VI）c0.0140X爷X100%mV式中：V2滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；Vi滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；c盐酸标准溶液浓度，mol/L；m试样质量，gV试样分解液总体积，mLV，一一试样分解液蒸储用体积，mL；0.0140与1.00mL盐酸标准液【c（HCL）=1.000molL相当的、以克表示的氮的质量。6.25氮换算成蛋白质的平均系数。七、重复性当粗蛋白质含量在25%以上

8、时，允许相对偏差为1%。当粗蛋白质含量在10%-25%以上时，允许相对偏差为2%o当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。浙江紫香糖业使用的定氮仪是上海新高型号：KDN-AZ智能型定氮仪蒸馈器KDN-AZ智能型定氮仪是我公司依据用户对仪器自动化的需求进行改进的一款半自动凯氏测定装置，在A型的基础上安装了自动蒸储掌握元件，使原木繁琐的蒸储掌握更为简便，提升了工作效率，保证了样品测定的精准性，并且加装了自动排水系统，用户不用担忧因蒸发炉水未排尽而造成下次开机消失烧保险丝的苦恼。测定范围：0.1-20Omg氮(0.05%95%)重现性：1%相对误差(包括消化步骤)回收率:99.5%-100%(l200mg氮)耗能：800W形状尺寸：380*330*750重量(KG)：26(可依据需要搭配消化炉)