原位杂交标准操作程序.docx
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1、原位杂交标准操作程序原位杂交一HBV标准操作程序检测原理:原位杂交技术的原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针,依据碱基互补配对原理,与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交,经信号放大及显色后,镜下观察结果。此方法具有很高的灵敏性和特异性。操作步骤:1.切片处理:将4um组织切片黏附在APES处理的载玻片上,切片于60-70oC烘烤60分钟以上。2.脱蜡:溶液次数*时间(分)二甲苯3*10100%酒精1*395%酒精1*380%酒精1*3蒸馆水1*3(注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全)3 .酶消化处理:甩干切片,将组织周围液体用滤纸吸干,每张切片滴加适量蛋白酶
2、K工作液(约503,根据组织大小增、减量),37孵育30分钟。4 .封闭内源性过氧化物酶:蒸储水冲洗,小心擦干组织周围液体,滴加适量过氧化物酶阻断剂(约50ul,根据组织大小增、减量),室温水湿盒中孵育10分钟。PBS液洗涤2*1分钟后,蒸储水洗涤1*1分钟,小心擦干组织周围液体。5 .杂交:(1)每张切片滴加适量杂交液(约25ul,根据组织大小增、减量),并加盖玻片;(2)放置于95。C原位杂交加热器中变性5分钟;(3)放入含30%湿盒增效液的湿盒中,37。C下孵育4-16小时。建议过夜(16小时)以保证低拷贝样本的杂交效果;(4)48oC(PBS预温)浸泡切片,小心移去盖玻片,PBS继续浸
3、泡5分钟;(5)48。CPBS洗涤3*5分钟(轻微震荡容器);(注意:杂交液量应与盖玻片规格匹配,切片在整个试验过程中要保持湿润状态,防止干片)6 .蛋白封闭:小心擦去组织周围液体,滴加适量蛋白封闭液(约50ul,根据组织大小增、减量),室温水湿盒中孵育5分钟;PBS洗涤1*1分钟。7 .信号放大与显色:(1)小心擦去组织周围液体,滴加适量一抗(约50UL根据组织大小增、减量),37,水湿盒中孵育30分钟;PBS室温浸泡3*2分钟(轻微震荡容器);(2)小心擦去组织周围液体,滴加适量二抗(约50ul,根据组织大小增、减量),室温,水湿盒中孵育20分钟;PBS室温浸泡3*2分钟(轻微震荡容器);
4、(3)小心擦去组织周围液体,滴加适量HRP聚合物(约50ul,根据组织大小增、减量),室温,水湿盒中孵育30分钟;PBS室温浸泡3*2分钟(轻微震荡容器);(4)小心擦去组织周围液体,滴加适量DAB显色液(约50ul,根据组织大小增、减量),室温,水湿盒中孵育10分钟。(不同样本的显色时间可能有所差别,建议镜下观察显色过程)。PBS室温浸泡3*2分钟(轻微震荡容器);(5)自来水冲洗,苏木精复染(可用HCl分化及氨水返兰梯度酒精脱水,中性树胶封片。阳性结果判断标准:肝细胞细胞核、胞浆或胞膜棕褐色着色。原位杂交一HCV操作规程检测原理:丙型肝炎病毒为一种RNA病毒,是经血感染肝炎的主要病原体。利
5、用HCV病毒的特有序列设计并优化的HCVRNA单链探针,能够特异地与HCV病毒保守区互补杂交,从而检测到石蜡或冰冻组织切片中的HCV病毒。该技术具有很高的灵敏性和特异性。操作步骤:1.切片处理:将4um组织切片黏附在APES处理的载玻片上,切片于60-70oC烘烤60分钟以上。2.脱蜡:溶液次数*时间(分)二甲苯3*10100%酒精1*395%酒精1*380%酒精1*3蒸储水1*3(注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全)3 .胃酶消化:甩干切片,将组织周围液体用滤纸吸干,每张切片滴加适量(约50ul,根据组织大小增、减量),1*胃酶工作液,37孵育15分钟。4 .封闭内源性
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