8.PCT主要生产实用工艺及反应体系地研究资料.doc

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1、word降钙素原PCT检测试剂盒胶体金法主要生产工艺与反响体系的研究资料胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一。某某鸿琪光学科技某某结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了降钙素原PCT定量检测试剂盒胶体金法，结合鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪对血清、血浆和全血标本中的降钙素原PCT进展定量检测。一、 反响原理描述人降钙素原PCT检测试剂胶体金法是一种不需要任何仪器设备的全血/血清/血浆检测法，采用胶体金免疫层析技术，试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维上的胶体金标记的抗PCT单克隆抗体(mAb1)以与固定于膜上测试区T的抗PCT单克隆抗体(mAb2)和质控区C的相应抗

2、体。测试时，将标本滴入试剂盒加样孔S内, 标本中如含有人降钙素原PCT，如此标本中的人降钙素原PCT分别与预先包被在玻璃纤维上的抗PCT单克隆抗体(mAb1)结合，结合物在毛细效应下向上层析，随后会被固定在膜上相应测试区的抗PCT单克隆抗体(mAb2)结合捕获，从而在相应测试区出现紫红色条带。如是阴性标本，如此相应测试区内将没有紫红色条带出现。无论标本中是否存在人降钙素原PCT，一条紫红色条带都会出现在质控区C内。质控区C内所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。通过金标免疫分析仪检测测试区T显色深度，再经过保存在卡壳上二维码上的定标曲线计算得

3、到检测结果。胶体金标记的根本原理是胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成结实的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记所用的主要原辅料有：抗PCT单克隆抗体(mAb1)、氯金酸、柠檬酸三钠，玻璃纤维。NC膜包被的根本原理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合，然后靠H键和疏水作用维持长时间结合。NC膜包被所用的主要原辅料有：硝酸素纤维膜、抗PCT单克隆抗体(mAb2)和羊抗鼠IgG。二、主要生产工艺的各主要工序流程图蓝色工序在10万级洁净区内进展，其他工序在普通生产区。领 料配包被用液体配标记用液体配包被溶液标记包 膜稀释金标交联溶液喷 金晾

4、干 干 燥No不合格品控制不合格品控制半成品检验半成品检验NOYesYes入 库入 库组 装NO o放 行成品检验不合格品控制总 装定 标Yes三、主要工序所用主要原辅料、具体步骤即每一步骤的具体实现方法该产品的生产工艺包括各种工作溶液的配置，胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定，胶体金标记物制备，检测线与质控线的制备等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合产品质量标准。一各种工作溶液的配置1 配标记用液体：胶体金制备：0.01%氯金酸HAuCl4，水溶液100ml加热至沸腾，参加1%柠檬酸三钠1ml，混匀，煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却即可。2

5、 配金标记物枯燥根底液包被缓冲液为10mM Tris-HCl，1.0%BSA, 0.01% NaN3，2%蔗糖。3 配包被用液体包被缓冲液为10mM Tris-HCl，2%蔗糖。4 配包被溶液检测线分别包被抗PCT单克隆抗体(mAb2)l/cm，电机速度511，二胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定1、胶体金标记物：分别以20ug/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体(mAb1)参加胶体金溶液中进展标记。2、检测线包被抗原浓度：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体(mAb2)，终浓度均为1.0mg/ml。3、对照线包被浓度：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml。三胶体金标记物的制

6、备采用枸橼酸三钠复原法制备胶体金，选择30nm胶体金颗粒用于标记，分别以20mg/ml最终浓度抗PCT单克隆抗体(mAb1)参加胶体金溶液中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。分别参加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟4000转，吸去上清，沉淀以金标记物枯燥根底液原胶体金溶液体积的1/10重新悬浮。置2-8保存，在规定的保存期内使用。以金标记物枯燥根底液对金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)进展按一定比例稀释， 然后l/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372，枯燥24小时。四检测线与质控线的制备取抗PCT单克隆抗体(mAb2)，l/cm，电机速度511在硝酸纤维素膜上制

7、备检测线，室温枯燥；取已确定使用的用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml，用同样方法制备控制线。检测线与控制线在NC膜上之间的距离约+0.5mm，线的宽度约0.8-1.0mm；前后均匀；并置温度1526；温度30%；枯燥24小时以上。五半成品检验按批号抽取一定数量的半成品检测，对所抽样的半成品做准确性、最低检出量、线性、精细性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量标准。六贴板、切条、装卡在温度1530；湿度25%条件下，将标记好的玻璃纤维、硝酸纤维膜、聚纸板、吸水纸、样品垫经特殊处理，可过滤红细胞1.0mm，然后装塑料壳。七定标利用公司内部校准品对试剂进展定标，定标曲线保存到二维

8、码中。(八)组装1把二维码贴到试剂卡壳上，并将枯燥剂、吸管等装入铝箔袋，封口。2装盒。九成品检验成品做准确性、最低检出量、线性、精细性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量标准。四、主要工艺确实定1 检测线包被浓度试验设计：固定加液量l/cm，电机速度511HZ，用包被缓冲液调整抗PCT单克隆抗体(mAb2)的包被浓度分别为0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.0 mg/ ml，分别进展包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原加样测试，每个浓度参考品平行测试20次，ng/ml参考品的测试平均值为M1，假如M1M0+2SD，明确最低检测限ng/ml95%置信

9、区间。试验结果：包被浓度M0+2SDM1结论：当包被浓度分别达到1.0mg/ml， 最低检测限ng/ml，而进一步提高包被浓度，这个项目的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检测线包被浓度均为1.0 mg/ml。2 对照线包被浓度试验设计：固定加液量l/cm，电机速度511HZ，用包被缓冲液调整羊抗鼠IgG抗体浓度为0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分别进展包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，以阴性标本加样比拟不同包被浓度对照线显色时间。试验结果：羊抗鼠IgG对照线显色时间超过4 min超过4 min2min2min2min,

10、对照线即在2 min内清晰可辩，符合设计要求。最终确定对照线包被浓度1.0mg/ml。3 胶体金标记抗PCT单克隆抗体(mAb1)的制备胶体金与标记蛋白用量之比确实定试验设计：将胶体金分装15管，每管1ml，每个项目5管。将抗PCT单克隆抗体(mAb1)分别以5g/ml、10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml浓度参加上列胶体金溶液中，快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟10000转，吸去上清，沉淀以金标记物枯燥根底液重新悬浮。以金标记物枯燥根底液对金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)进展按一定比例稀释， 然后l/cm，喷笔口径为10mm，将喷

11、好的玻璃纤维放置烘房中，372，枯燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。分别进展包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原加样测试，ng/ml参考品的测试平均M1，假如M1M0+2SD，明确最低检测限ng/ml95%置信区间。比拟不同标记蛋白用量的灵敏度上下。结论：当标记浓度分别达到20g/ml, 试剂盒能满足检出要求，而进一步提高包被浓度，这三个项目的检测线显色程度没有明显的改变。最终确定标记浓度均为20g/ml。抗PCT单克隆抗体(mAb1)稀释浓度确实定试验设计：将抗PCT单克隆抗体(mAb1)用金标记物枯燥根底液按1：1、1：2、1：3比例进展稀释，稀释好后按固定喷金参数，将

12、金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)喷在玻璃纤维上，枯燥，按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原ng/ml参考品的测试平均M1，假如M1M0+2SD，明确最低检测限ng/ml95%置信区间。比拟不同标记蛋白用量的灵敏度上下。结论：只有当稀释度达到1：1时，最低检测限ng/ml，符合设计要求。最终确定金标单抗稀释度为1：1。4 设计定型通过以上实验，我们确定采用的生产工艺为：（1） NC膜包被：检测线：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体(mAb2)到终浓度为1.0mg/ml。对照线：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml。包膜参数：l/cm，电机速度511HZ。将包被好的NC膜放

13、置烘房中，372，枯燥24小时。2胶体金标记：以20mg/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体(mAb1)参加胶体金中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟4000转，吸去上清，沉淀以金标记物枯燥根底液重新悬浮。然后用金标记物枯燥根底液分别按1：1进展稀释，然后l/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372，枯燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。成品检验方案：组装成的试剂条是否在15分钟内检出降钙素原。成品检验结果：组装成的试剂条能在15分钟内检出降钙素原。结论：该生产工艺生产出来的试剂条符合我们的产品要求，确认为以后采用的生产工艺。五、质

14、控标准与内部质控品确实立1. 企业标准的制定的缘由由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准，我们参考已上市的人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标，设计了本品的企业内部标准，制定了内部校准品和质控品。2.1 准确性标准：取PCT零浓度参考品，作为根底样本，将其等体积分为4份，在任意3份中添加PCT纯分析物，使参加浓度分别为5ng/ml、15ng/ml、40ng/ml，制成3份回收样本，分别计算其回收率，然后计算平均回收率，平均回收率应95%。2.2 最低检测限标准分别以降钙素原ng/ml参考品的测试平均M1，假如M1M0+2SD，明确最低检测限ng/ml95%置信区间。最低检测限必

15、须ng/ml。用50ng/ml的高浓度参考品和0.1ng/ml的低浓度参考品，混合成8个稀释浓度Xi，每个浓度测定3次，分别求出检测结果均值即为实测值Yi。以稀释浓度Xi为自变量，以检测结果实测值Yi为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数r与线性相对偏差，要求线性相关系数r0.975，线性相对偏差不超过15%。批内：用同一批次试剂盒分别对企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品进展检测，各平行测定10次，批内变异系数CV15%。批间：取三个不同批次的产品，分别测定企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品，每个批号重复检测10次，批间变异系数CV20%。3. 内部质

16、控品的制备3.1 最低检出量质控品的制备和验证3.1.1 降钙素原零浓度质控品的制备和验证 制备方法：10份经确认PCT为阴性、无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜颗粒，HIV抗体、HBV抗原、HCV抗体检测均为阴性的血清标本，进展混合。经离心、过滤等处理后，然后经罗氏诊断产品(某某)某某的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)进展检测,确认PCT浓度为0ng/ml，加2/万叠氮钠，分装标识后，-20或以下温度保存，有效期2年。验证方法：将降钙素原零浓度质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒胶体金法上加样检测，要求检测结果为0.1ng/ml，说明该质控标本可以作为本试剂盒的零浓度质控品。降钙素原定值质控品的制

17、备和验证从Hytest公司购置PCT纯化品，用零浓度参考品作为根底液进展稀释，稀释到一系列浓度，经罗氏诊断产品(某某)某某的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)检测,确认PCT浓度分别0.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100 ng/ml和120ng/ml。加2/万叠氮钠，分装标识后，-20或以下温度保存，有效期3年。验证方法：将降钙素原零浓度质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒胶体金法上加样检测，检测结果与靶值偏差15%，说明上述质控品可以作为本试剂盒的定值质控品。 见附件1降钙素原公司内部校准品的溯源过程与定值可靠性验证六、样本要求全血/血清/血浆标本应收集在洁净、枯燥不含有任何防腐剂的塑料和玻璃容器中，全血/血浆样本对临床常用抗凝剂EDTA、肝素钠、枸橼酸钠无要求。7天内，可保存于2-8冷藏，长期保存需冷冻于-20，忌反复冻融。8 / 8