毒素提取发酵液、菌丝分开提取检测吸收.docx

1 .毒素提取发醉液、曲丝分开提取，检测吸收峰.接种染色确定以后用毒素的来源接种提取DNA,过魁化氮，超氧阴离子测定方法452 .幼苗浸渍法（花生.烟草,草海）3 .根冠细胞提取（花生，烟草）4 .叶肉细胞提取（花生,烟草）若用叶片作为材料,取已展开的生活叶片,用0.53%次圆酸钠和70%酒精进行表面灭菌.然后切成2cm见方.把4g叶组织置于含有20Om1.不加点和琼脂的培养基50Om1.三角瓶中.在4,C黑暗条件下培养1624h,以后叶片转入含有纤维素的、果胶椀、无机盐和缓冲液的混合液中,pH值为5.6,通常在甜液中使用的等渗剂为0.55.6mo1.甘露醇.然后,配液!空渗入叶片组织.在28C条件下.每分钟40转的旋转式转床上培养4h后,叶片组织可完全分离.若用悬浮培养细胞,可不经过果股的处理,因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成.取悬浮细胞放入IOmI的随液中（3%纤维素就14%蔗就PH值5.06.0）.在2533t条件F的解24h.原生质体前混合液用30Um的尼龙网过滤.通过低速离心收集原生质体5.质原过氧化6 .接种叶片（花生,烟草）毒素原液（采用尾胞菌素相对定尿）稀柞倍数（2,10.100）清水不接种足抱苗素（浓度）7 .取样染色面积时间尾抱苗素消水毒素原液稀择2倍稀株10倍稀徉100倍空白0182022243240离心5min,奔去上清液。(4)用34m1.1.3%CPW液洗涤并溶解沉淀，悬液经100Oipm离心5ni留Im1.匕消液,其余弃之。取IOm1.离心管1支，注入3m1.20%25%蔗糖，将沉淀的原生质体悬浮，用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖溶液k,100Oipm离心58ni,将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一肉心管中，沉淀制一张装片，观察。(6)用13%CPW液洗涤1-2次，每次100OIPm离心5mi,得到较为纯净的原生质体。用13%CPW液悬浮至一定密度并制一张装片，观察。(7)取1滴原生质体捉取液在载玻片匕加入相同体积的0.02%FDA稀释液，静置2nIin后，于荧光显微镜卜观察，发绿色荧光的为行活力的原生质体，没有产生荧光的原生质体无活力。(8)将1-2滴原生质体混合物(密度分别为105-106/m1.)滴入小培养皿,静置810分钟。相对方向加入2滴40%的PEG溶液，静置10分钟,依次间隔5分钟加入0.5m1.、I1.nI和2m1.含13%甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、二次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡：最后用液体培养基洗12次即可进行培养：染色方法J12.01浓缩提取液试验菌株为39号光：发酵液，菌丝J暗：发酵液，菌丝J染色方法：DAB染色：DAB染色剂抽真空20min.NTB染色：NTB染色剂抽我空20min.接种烟草叶片12.02配匿误文斯蓝染色剂”）.25%）水配置（O.25g.100m1.水）诜文斯蓝染色2（）min,蒸馀水洗净，液氮研匀.放在0.1%十二烷基磷酸钠（SDS）Iomin37.离心13.000xgfor5min.上消液分光光度法测量，at60（）nmDAB染色：DAB染色:抽真空20min.固定液（酒精:乳酚=2:1）煮沸5min,叶绿素完全脱色后，放在饱和水合筑醛中透明，存放在甘油中保存。NTB染色:NTB染色剂抽真空20min,同上，煮沸5min测址OD值稀释IO倍。对已经接种的进行染色PD.MM.CM（固体，液体）白，红液体六种提取液分别接种叶片CM,MM用半组合培养基.独子接种