花生疮痂病菌毒素（ESC）对寄主细胞损伤及凋亡机制研究的项目可行性研究报告.docx

花生疮痂病菌毒素（ESC）对寄主细胞损伤及凋亡机制研究的项目可行性研究报告一、项目提出的目的和意义（1）花生疮疝病国内外研究花生（AraChiShypogaeG是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第一。我国花生种植面积较广，主要分布在山东、河南、河北、安微、广东、江苏和辽宁等省区，据国家粮油信息中心提供的数据显示，2013年我国花生种植面积已达471万公顷.花生疮痂病（SPhaeeMnaarachidisBitaucoiirtCtJCnkinS）主要危害叶片和茎秆，形成大量疮痂状病斑（图1）。自1940年BitaUCOUrt首次在南美的巴西发现之后，日本（根岸宽山等,1979）和阿根廷（GiOrdae/R,1985）等国家也相继报道，并在各花生产区Sft行成灾。近年来，我国广东、广西、福建、山东和辽宁等主要花生产区相维发生危害，分布广，危宙重，属典型的流行性病害。一般病田减产10%-30%,严重田块损失可达50%以上.辽宁省2009年仅在葫芦岛花生产区零星发生，2011年葫芦岛、阜新和锦州多个花生产区爆发式流行成灾，病田率75%700%,病株率82.6%100%,病叶率42.5%-95.3%,病情指数I8.1.535,发生面枳超过12万hm?（周如军等,2013）,截止到2015年奥季已经传播到辽宁北部产区，且有维续苣延的趋势，已成为我国花生产业持续发展中亟待解决的植保问题。图I花生疮痂病典型症状特征（左：叶片症状：右，茎杆症状）花生.疮痂病（SPhaCdo"iaarachidisBitaucourtetJcnkins）属近年来新流行病害，国内外研窕报道较少日本学者根岸宽山在上世纪7（1.8O年代时日本该病病原学进行了研窕，明确了病原菌为Sp/wcM。，"”"rac加（加（根岸宽山等，1979）。巴西学者KCamCy对病残体和种子在花生疮掘病传播过程中的作用进行了研究，明确了田间病残体是该病初侵染源之一(KcamcyerR,2002),以菌丝体和分生.胞子盘在病残体上越冬，翌年产生分生胞子，借助风雨传播。国外尚未见其他相关研究报道。目前国内研究主要集中在病原学、发生调查(方树民等，2007：李峰等，2012)侵染特性(郭陞秀等，2015)化学防治(田云云等，2014)等领域，申请人近年来在其病原学、流行因素分析、流行动态、抗性鉴定和田间防治等方面进行了系统研究并取得了相应结果(周如军等.2012,2014).而国内外在病害致病因子、侵染机制、寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基础较为薄弱，极大限制了该病宙的深入研究，无法为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。(2)植物病原真菌毒素在致病过程中的作用机制植物病原我菌与植物在长期协同进化和复杂的互作过程中，逐渐形成有利于致病性的进化，产生多种对寄主植物有害的物质统称为致病因子，致病因了的种类、含量及其活力决定其致病力强弱，进而影响病害的发生和严重程度.近年来，病原真菌致病因子及其机理研究已成为植物病理学的研究热点。研究表明，病原久前致病因子主要包括施类、毒素、激素和蛋白类等多种物质4,其中毒素是尾胞菌(Cerv。SPom)、镰抱菌(Fusarium)、链格抱(A1.temariG等多种重要植物病原真菌的致病因子.研究病原真菌毒素及其作用机理对于了解病闺致病机理、寄主与病原物的互作机制、抗病育种和寻找新的病害防治途径具有重要意义。病原真菌揖素种类繁多，主要包括蛋白类，如小麦褐斑病的(Pyrenophomtntc-repentis)产生的PTR谁素和棉花黄萎病菌(½"id加，J4""e产生的VD毒素：苔类，如甘原眼周病菌(Hc/而加MWrj“，scc<"0产生的长蠕白糖：脂类，如甜菜尾胞病菌(ce；WW仪Me产生的H.油三酯类毒素：杂坏类(花醒类、酚嘏类、菲醍类等)以及第基酸衍生物等类群。其中龙鼠类毒素由于其具有光敏性可引起膜蛋白交联、膜脂过氧化、膜流动性改变、细胞骨架损伤、DNA损伤等作用而备受瞩目。花品类毒素主要包括交缝施毒素型、弗莱菌素型以及以金丝桃素为代表的其他类毒素.其中弗莱菌素型包括的尾抱菌素和痂囊腔菌毒素是葡萄黑疽病、柑橘疮加病、大豆灰斑病、玉米灰斑病等重要作物病杏的主要致病因子。前期研窕表明尾胞菌毒素痂囊腔菌毒素是病菌侵染寄主植物的重要毒力因子<1.iaoeR,2OO8)°尾抱菌素(CerCo$Porin)是由尾刑属真菌(Cen产生的红色的毒索，首次在(Cen:o$POraIdkUChii】中分离得到(OkubOe1975)。痂囊腔菌素(EISin(KhrOmC)是由加囊腔菌(以立"。力产生的红色或橘灯.色的蠡素，1957年Weiss等人首次在痂囊腔菌属真菌中发现，主要包括A、B,C和D四种衍生物(WeiSSe/R,1964；1.ousbergeta1.1969),尾泡菌素与痂囊腔菌索的生物合成还受到众多生理生化、物理因子的影响，其中光和氧气是两个必不可少的关健因素。CERSPORINCercosporaipp图3足用的素结构图2布囊腔苗素结构花根类植物毒素(尾弛菌素与痂囊腔菌素)具有明显的光敏作用，在Kuang-RenChUng等人对大豆灰斑病、柑橘疮揄病等病害的研究中，证明光有利于北阻类植物毒素的产生I1.与其毒力大小为定的相关作用，光存在时会与氧反应产生对细胞有毒宙作用的活性氧,光敏作用一般分为类型【和类型H两种机制，光敏剂吸收光后，首先激发到寿命很短的单或态，然后系间穿越到三重态，后者相时单选态来说更稳定，寿命更长，因而光做作用通常通过三重态来进行。光敏剂的三重激发态可进行两种类盘的反应：机制I通过电子转移或抽药反应与底物相作用，产生底物和光敏剂的自由基，这些自由基与周阳的氧反应产生氧化物，如超氧阴离子自由基(02)及羟基自由战(OH)等；机制H光破剂的三重态与基态辄发牛.电子转移或能量转移产生超氧阴离子自由基(02)和雌重态氧CO。，后者是一种高亲电反应活性的物种,能行效地氧化生物分子(Guedesera/,2007)。在光敏作用中I型机制和H型机制同时出现，它们的相对强弱取决于溶剂极性、底物和光敏剂的特性和浓度、氧的浓度以及光敏剂与底物间的键合作用。由此可知氧与光敏作用密切相关，I1.在大多数光敏反应中O2是主要活性物种,但0?和QH的作用也不可忽视。活性氧(ROS)在寄主植物和微生物相互过程中起到重要作用。如在细胞发病机理过程中,NADPH氧化旃(NOX)信号诱导氧爆发以及程序性细胞死亡的反应是寄生对入侵病原体的防御反应.与病原真菌后接触后，植物质膜结合的NOX活性提育,导致包括过氧化级(HQC在内的活性氧的快速枳累，其扩散进入细胞并激活植物防御(APdeta1.,2004)。最有代表性的植物防御反应是由ROS的积累和ROS清除旃的抑制产生的程序性细胞死亡响应，即过敏性坏死反应。ROS也参与防御的其他模式，如形成细胞壁的氧化交联的障碍以及抑制病原体侵入(Shct1.yefH,2008)。花胆类植物毒素产生的活性氧(ROS)对寄主植物细胞具仃极强的毒害作用。产毒病原真菌的致病机理包括三个可能过程：1)病原菌在侵染前释放毒素作为信号分子：2)择放的港索选择性地和寄主细胞上的受体位点结合：3)解放的毒素抑制植物对真菌的侵染和定植的防御反应。因此，毒素对寄主产生的生理生化影响往往是通过与寄主体内的一种或几种生物大分子(靶分子)相互作用产生的.毒素进入寄主体内，通过与寄主体内特定靴分子相互作用，改变寄主原来正常的生理过程，引发一系列细胞学和生理生化反应，并最终使寄主产生一定的症状，如镰刀菌产生的毒素致使植物萎蕉，链格把毒素使寄主坏死，长蠕泡毒素使植物产生褪绿现象；尾抱属及痂囊腔菌属产生的毒素可使植物细胞膜过氧化，导致病害扩大危害，病情加重。尾胞菌素与痂囊腔菌素等花瓶类毒素均为脂溶性，在渗入细胞后可以作用于多种细胞器，包括溶的体、内质网、高尔基体、甚至破坏含有核酸的叶绿体和线粒体以及细胞核等。尾胞菌素与痂囊腔菌素主要作用位点在细胞膜上,如在烟草悬浮细胞及柑橘原生质体中，添加尾泡菌素与痴囊腔菌素均能使细胞死亡。尾抱曲素与痂囊腔曲素在细胞间通过光敏作用产生的Q?以及其他活性氧种类，使细胞膜过氧化，电解质泄露到细胞间,为病原菌正常生长和产泡提供营养条件.接种叶片及培养液的初始电导率及总电导率的测定显示叶片中以及细胞中的电解质泄露到溶剂中，证明细胞膜的流动性降低，细胞内电解质泄露，细胞膜破裂，导致细胞死亡花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病需，发生.区域广，危杏极为严重，殷病田减产10%30%,严重田块损失可达50%以上。仅辽宁2011年发生面积超过12JjhnR形成爆发式流行，危击极为严亚，且有向北继续鹿延的趋势，已花生产业持续发展中酮待解决的植保问题。而国内外对于花生疮痂病的研究基础较为薄弱，缺乏病菌侵染过程、致病因子筛选、致病机制及寄主损伤机理等基础研究工作，无法诠释病菌与寄主之间的互作关系和互作机制，对F该病害的深入研窕及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发带来了巨大的理论屏障。以此为切入点，本项目以花生疮痂病菌为研究对象，深入开展花生疮痂病菌毒力因子筛选、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，探索花生疮痂病曲与寄主的互作模式和机制，研究结果该痛击的深入研究和后期花生的抗病育种具有重要意义。结合申请人前期对辽宁花生疮痂病侵染过程和流行因素的研究基础，本顼目的研究结果可以很好地解择近年来辽宁花生产区花生疮师病爆发式流行因素和流行机制。项目研究过程中会建立花生细胞悬浮体系，并对各种因素进行优化，该技术时于花生的遗传转化和功能基因的转化提供材料和技术支持.另外，本研窕中将会探讨淬灭剂和金属高子对花生疮痂病的毒素的缓解和抑制作用，进而减轻病害的发生和流行程度，该部分研究结果对于寻找新型、安全的病杏防治方法提供了理论支持，对于花生减量使用农药具有重要意义。花生已成为辽宁省第三大作物，种植面积早已突破600万亩，且随若农业产业结构调整，玉米栽培面枳减少，花生.产业的发展势头持续见好。而花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病害，发生区域广，危害极为严重。结合前期研究，该项目的股利实施，不仅能够完善花生疮痂病的致病机制的理论探讨，同时刻于我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义。二、项目研究内容和研究方案（可行性分析）1 .研究内容(1)花生疮损病菌毒素对寄主损伤和细胞。亡的作用。花生疮疝病菌毒素对病病斑形成和扩展的影响基于前期病原菌侵染过程研究基础，明确花生疮痂病菌毒素对病菌侵染及病斑扩展的影响。花生疮疝病菌毒素对细胞凋亡的作用基丁前期建立的花生细胞悬浮培养系统，分别加入不同浓度的花生疮痂病菌毒素，通过相应的染色方法测定细胞死亡率和存活率，明确毒素对花生细胞的损伤和细胞渊亡作用。(2)花生疮疝病菌毒素在寄主-病菌互作过程中的作用机制花生疮痴病首毒素对寄主防御舞的影响动态测定花生疮加病菌毒素对寄主防御的的响应动态，确定毒素对寄生生理生化的的影响，进一步证明花生疮痂病菌毒素是否为花生疮掘病菌的毒力因子.花生疮痴病菌毒素对寄主细胞质膜过气化的影响利用细胞悬浮体系通过测定寄主细胞膜的选择透过性、流动性、细胞膜随活性和质腴过氧化程度，探索毒素时寄主植物细胞膜水平的毒害作用“花生疮癫病苗毒索对活性氧产生动态及鲍胞凋亡的作用机制利用细胞悬浮体系测定花生.细胞程序性死亡过程中的1。2、O2-以及HzO2三种不同活性氧种类及其含量,分析与细胞凋亡的关系，明确奇素对花生细胞凋亡的作用机制。(3)漳灭剂对花生损伤和细胞凋亡的抑制作用明确淬灭剂种类和浓度对寄主细胞周亡的缓解或抑制作用，通过添加不同类型的活性氧淬灭剂,探索不同类型活性氧作用，进步证实施素.在花生疮痂病菌致病中的主导作用。2 .研究目标和拟解决的关健科学问题(1)花生疮疝病菌毒素在细题膜的损伤植物细胞膜是细胞的重要组成部分，起若调节控制细胞内外物斯交流的屏障作用，当植物遇到逆境条件时首先破坏细胞膜结构，改变细胞随活性，导致细胞渊萎或死亡。花生疮痂病菌毒素在病菌侵染植物组织过程中是否破坏细胞膜结构、损伤程度及毒害水平是本项目需要解决的一个关键问题.本项目拟利用细胞悬浮体系测定毒素对寄主细胞膜透性、脂质过氧化和质膜过氧化的影响，探索毒素对寄主植物细胞膜水平的毒害作用。(2)花生疮相病菌毒素在寄主.病首互作过程中的作用及其机理病原真菌在致病过程中寄主-病菌互作是植物病理学的一个研窕热点，也是本项目需要解决的另一个关键问题。本项目拟利用细胞悬浮体系从细胞膜损伤、细胞程序性死亡过程中的活性氧种类及其含量以及活性氧在致病过程中的作用机制进行正向证明，利用泮灭剂进行反向证明，旨在充分论证毒素在致病过程中的作用方式和作用机制。3 .研究方案和试验方法(I)花生疮病病毒素对寄主损伤和细胞舞亡的作用花生疮疝病菌毒素对病病装形成和扩展的影响采用前期病原菌侵染机制中的接种方法，以花生疮加病菌毒素接种寄主植物叶片、茎干，在不同的环境条件下，通过网格法测量叶面积，以浸染位点数计算侵染概率。明确花生疮施病菌椎素对病斑形成及扩展的具体作用。花生疮疝病菌毒素对细胞凋亡的作用建立花生、烟草的细胞悬浮体系，细胞活力采用氯化三苯基四赳(TTC)法测定，通过紫外分光光度法确定花牛.疮摭病菌傩素的浓度，将不同浓度的花生疮痂病菌毒素添加到不同密度的悬浮细胞中，通过荧光染色法检测细胞存活率，利用扫描电镜检测细胞内结构的凋亡特征以及对细胞存活不同时期迸行DNA条带分析，时细胞凋亡的过程进行动态观测分析。(2)花生疮痴病菌毒素对寄主细胞凋亡作用机制研究花生疮疝病菌毒索对寄主防御鼻的影响动态在对细胞程序性死亡研究的堪珈上，采用测定植物叶片及悬浮细胞过氧化气醯(CAT).过氧化物的(PoD)、苯丙氨酸解氨的(PA1.).多酚氧化瓶(PpO)、超氧化物歧化的活性(SoD)，确定在花生於痴病菌毒素浸染叶片及毒害细胞的过程中寄主植物及细胞的生理变化及花生疮痂病菌毒素的作用机制。©花生疮疝病菌毒素对寄主细胞质膜过氧化和脂质过氧化的影响通过测定花生疮痂病菌毒素的PC值确定其主要作用位置，采用测定饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值以及细胞膜上Ht-ATPasc.CaiATPaSC的活性确定细胞膜的活性大小，丙二联(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定，膜破裂程度以电解质渗透率为指标,探究花生疮加病菌毒素对细胞损伤的机制,明确花生疮痂病菌毒素对寄主植物及细胞内的具体作用部位。花生疮痂病菌毒素对活性氧产生动态及细胞凋亡的作用机制花生疮痂病菌毒素的加入使植物体内产生过量自由基，自由基有极强的氧化能力.能通过氧化反应来攻击细胞膜.工的产生及其氧化产物的含量采用DaubandHangarter(1983)的方法进行测定：O?产生用四降氮蓝(NTB)方法测定：H。的含量采用Uchida等的方法。(3)淬灭剂对花生损伤和细胞调亡的抑制作用淬灭剂对花生疮痛病的抑制作用选取胡萝卜素、DABCO.维生素E、维生素B6、维生素C、谷胱廿肽、肺氨酸、半胱氨酸等不同的活性轨淬灭剂，在花生疮痴病菌毒素接种的不同时期进行涂抹,通过测定病斑扩展速率以及侵染概率明确单线态氧等活性氧在浸染中的机制，为防治花生疮痂病提供理论基础。淬灭剂对寄主细胞舄亡的抑制作用选取胡萝卜素、DABc0、维生素E.维生素B6、维生素C谷胱甘肽、IM氨酸、半胱氨酸等不同的活性氧淬灭剂，通过TTC等柒色法测定细胞活性，确定淬灭剂时细胞凋亡的抑制作用.4 .技术路线5 .项目可行性分析(1)研究基础和研究方案的可行性：项目申请人所在团队长期从事花生病害研究工作，具有扎实的研究基础.，项目申请人近5年来先后主持参加/辽宁省科技攻关项目“花生病虫害安全控制技术体系研究(2011214002)”、辽宁省博上启动基金项F1.“花生疮咖病流行动态及其模拟模型的研究(201311()6)”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痴病侵染机制及其流行成灾关键因子研究(2014056)”等多个相关研究课题，时花生疮痴病的分离培养技术、生物学特性、致病性、发生规律等方面进行了系统研究，发表多篇论文，相应研究基础扎实。近年来开展了花生疮狮病菌不同菌株产毒能力、致病性差异和产毒条件等研究工作，为本项目的顽利实施奠定很好的前期研究基础（具体在研究工作基础和条件中阐述）。本项目试的设计合理，试瞬方法和试验方案可行。（2）研究条件的可行性，课题组所在的植物病害流行研究室依托辽宁省及农业部重点学科植物病理学科及辽宁省植物病害重点实脸室，技术力量较强，设备条件先进，近年来学校为学科投入大量经费进行设得仪器添置和更新换代，能够满足本课题研究过程中所用仪器和设备的需要。WatChDOg2450型人工气象站（美国SPECTRUM技术公司），TPJ-20型温湿度记录仪（浙江托普仪器有限公司），RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪JSD.HH-6型数显恒温水浴锅（国华电涔有限公司），HCraeUS型高性能台式冷冻离心机（德国），循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），GZP-25O型光照恒祝培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂）,WaIerS600E育效液相色谱系统（包括60（）E四梯度元泵、真空脱气机、2487双通道可调紫外-可见波长检测器），CO-601柱温箱，色谱柱（WatersSunfireC185m4.6×150mm）.保护柱（penomenexC185m4×3.0nm）、半制备柱（Waterssunt1.reC1819nn×150mm）,紫外可见分光光度计1.ambda25（PerkinEImer）.红外分光光度计IFS-55（Brukcr）.PCR基因扩增仪（英国，Hybaid1.imited）,电泳仪（DYY-12型，北京六一仪器厂）.台式高速冷冻离心机（Eppendorf58O4R），UVP凝胶成像分析系统UVPGe1.Doc-ItSystem），酸度计（JENWAY4330】，超低温冰箱（SANYOMDF-U32V）,光照培养箱（SANYOSGC660）等仪器设备。（3）研究人员配置和知识结构可行性I项目组成员具有高级职称2人，中级职称1人，均为固定研究人员，生要从事植物病害流行学和宏观植物病理学教学和研究工作，另外配备4名研究生进行花生疮痂病专项研究工作，研究人员梯队和知识结构搭配合理，能够完成本项目的试验实施、数据分析、论文发表及课题总结等工作。6 .项目的特色与创新之处.（1）在花生疮掘病研究过程中，首次揭示花生疮痫病菌毒素为花生疮痂病的毒力因子，为花生疮痂病的致病机制的研究提供理论基础。（2）利用细胞悬浮培养技术在细胞膜和活性氧两个方面研究花生疮痂病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能够更加准确地阐述其作用机制。（3）通过添加活性氧淬灭剂探尢其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明毒素是花生疮摭病菌的重要致病因子，而且研究结果能够为花生疮施病的综合防治提供一个崭新的视角.三、年度研究计划及预期研究结果1 .年段研究计划第一年（2017年）：优化花生细胞悬浮体系：利用花去疮痂病菌毒素对花生进行接种，明确其在侵染过程中对病斑扩展的影响：测定明确花生痂囊腔菌毒素在植物发病过程中生理生化等动态变化，进而为花生痂囊腔的毒素致病机制的更深一步研究做好研究基础。第二年（2018年）：提取花生疮痂病菌毒素，并加入到花生细胞悬浮体系中，通过对细胞损伤的测定、细胞内丙二醛的产生以及其产生活性氧对细胞的毒杏作用的研究，明确花生痂囊腔菌帝素对细胞损伤及其使细胞膜过氧化的机制，探索其诱导细胞程序性死亡的的机制。参加国内外学术会议1次。发表学术论文1-2篇。第三年（2019年）：花生疮痂病菌毒素对活性乳产生动态研究：活性氧在细胞耐亡过程中的作用机制：通过添加能使其失活的淬灭剂等试剂，明确淬灭剂对细胞损伤以及花生疮痴病的抑制作用，整理研窕结果，撰写结题报告，撰写研究论文1-2篇。2 .颈期研究结果（1）明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中对细胞膜的损伤和毒害作用：（2）分析活性氧在花生细胞程序性死亡和寄主-病菌互作过程中的作用及其机制：（3）探索毒素在花生疮痂病的致病过程中的生理生化机制。（4）明确活性氧猝灭剂对花生细胞凋亡的缓解或抑制作用及对病宙侵染扩展的防控机制。（5）发表研究论文2-3篇，其中SQ论文I篇，培养研究生2-3人。四、研究基础与工作条件1 .工作基础申请人近年来主持2项与花生疮痂病直接相关项目.即辽宁省博士启动基金项目“花生疮热病流行动态及其模拟模型的研究20131106）”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮庭病侵染机制及其流行成灾关健因子研究（2014056）”项目。博士启动基金已例满完成结题工作。在以上课题的资助下，开展了花生疮施病病原学、分离扩繁技术、抗病性鉴定、流行动态和流行规律等研究工作，并发表多篇学术论文。对于本项目的研究内容，课题组进行了相应的前期研究工作。已完成供试首株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作，被止到2016年末课题组已完成辽宁省、江苏省、山东省等主要产区菌株收集工作，共获得的株400株。井获得柑橘疮痂病菌和葡葡黑豆病菌2株对照菌株。花生疮痂病菌分离培养难度极大，且菌落生长速度级慢（30天菌落直径约为2.1cm），前期研究掌握了病菌的分离培养及扩繁技术，建立J'一套病菌稀释单菌落分离及研磨快速扩繁体系，并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产毒差异（如图：完成了已获得菌株的形态和分子鉴定工作，在对病菌分子特性研究的基础上撰写完成了Mo1.ecu1.arandPathogenicityCharacterizationofSphace1.omaarachidisIso1.atesfrom1.iaoningprovinceinChina论文（投稿）。图S花生疮痴病萧培养性状（左I病赭快速扩繁：中：病曲产毒能力；右：部分曲株培养性状篇选出不同抗感品种：前期已完成了辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，对于病原菌的生测提供了试验材料（周如军，2013：2014）.建立了白沙1016的细胞悬浮体系，花生细胞悬浮体系的建立是该项目顺利实施的保障之一。课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立了细胞悬浮体系。（愈伤组织诱导：MS为基础培养基，添加1.5mg1.的24D、1.0mg1.的KT+3.0mg1.的6-BA：悬浮培养：MS液体培养基为基础培养基.2.5mg1.2.4-D+1.5mg1.KT+2.5g1.6-B+3（）g1.谶糖，培养2（M）0花生疮庭病H毒素提取条件的初步建立：课髭组在前期研究的基础上已经掌握从花生疮痂病菌中提取毒素的方法。将烘干的菌饼置于内剧中连续两次萃取16h后合并.溶液经旋转蒸发挥去两胴后，将瓶壁用Im1.丙酮溶解得到花生痂囊腔菌毒素提取液，用薄层色谱法进行鉴定。薄层层析法鉴定花生疮标病菌毒素（荧光下）薄层层析法鉴定花生疮痂病菌揖素t1.光下）2 .工作条件（1）课题组拥有大:先进仪器设备.课题组所在的植物病击流行研究室依托农业部北方农作物病需免疫重点开放实验室和辽宁省及农业部重点学科植物病理学科，技术力员较强，设备条件先进，近年来学校为学科投入大量经券进行设备仪罂添置和更新换代，能够满足本课题研究过程中所用仪器和设备的需要。Wa1.ehDOg2450型人工气象站（美国SPEcTRUM技术公司）,TPJ-203温湿度记录仪（浙江托普仪器有限公司），RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器J）HH-6型数显恒温水浴锅（国华电器仃限公司），HenIeUS型高性能台式冷冻离心机（德国），循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），GZP-25O至光照恒温培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂），Watcrs600E高效液相色谱系统，紫外可见分光光度计1.ambda25（PerkinE1.mer）,红外分光光度计IFS-55（Bruker）.核磁共振波谱仪AVanCe-600MhZ（BrUker）,质谱仪MiCrO1.of-Q（Bruker）»PCR庙因扩增仪（英国，Hybaid1.imitcd）,移液枪（C国，CppcndorD,电泳仪（DYY一12型，北京六一仪器厂），超纯水制造系统（美国，M1.1.1.1.-Q）,台式高速冷冻离心机（Eppendorf5804R）.UVP凝胶成像分析系统（UvPGeIDoc-ItSystem）,酸度计（JENWAY4330）,超低温冰箱SANYOMDF-U32V）,冻干机（Hcto）,光照培养箱（SANYOSGC660）等仪器设备。（2）课题Ia拥有较好的研究梯队目前课题组拥有该课题研究方向专职研究人员8人，其中教授I人，副教授I人，讲师I人，硕士研究生5人，研究力量雄厚，梯队合理，能够保障课题的顺利实施。五、申请团队前介周如军（项目申请人），男，汉族，1979年IO月生，副教授,现工作于沈阳农业大学植物保护学院，主要从事植物病吉流行学和植物真菌病害教学和研究工作。申请人2002年毕业于沈阳农业大学植物保护学院植物保护专业，2005年7月获得植物病理学硕土学位，同年帝校任教，2007年晋升为讲师，2010年获得有害生物与环境安全专业博士学位、2011年晋升为副教授.自工作以来，先后主讲“普通植物病理学”、”植物病害潦行及预测预报''和"药用植物病理学”等本科生课程。2007年获沈阳农业大学优秀指导教师称号，主讲课程获沈阳农业大学一类课称号，自主编制药用植物病理学网络课程先后获辽宁省教育软件大赛三等奖和“第十届全国多媒体课件大赛”理科组一等奖，并构建网络教学课程网站（h1.3'pdc.sau.cducn'ki）。第一作者发表教改论文I篇，副主编教材2部,参编4部。科研工作中，2009年主持沈阳农业大学吉年教师基金项目2项，201（）年主持“稻曲病流行动态及预测预警模型研究”（公益性行业科研专项经费项目稻曲病控制技术的研究子课题）I项，作为第一参加人参加国家自然基金项目（“双株定向栽培模式对玉米纹枯病流行影响及灾变机制研究（项目批准号：31171791）、”辽宁省科技攻关项目（“花生病虫害安全控制技术体系研究（20112MoO2）”八辽宁省科学基金等多个项目。2005年研制4药用植物病害诊断与防治专家系统1项，2007年自主建立“药用植物病虫害防治网站(h1.tp:PdCs),傅俊范.男，蒙古族，1958年IO月生，辽宁省朝阳县人，中共党员，博上，教授,博士生导师。现任沈阳农业大学植物保护学院院长，兼植物保护一级博士点学科带头人,辽宁省植物保护一级重点学科带头人，辽宁省和农业部重点学科植物病理学科带头人，辽宁省植物病理重点实险室主任，辽宁省植物免疫Iii点实验室主任，沈阳农业大学植物病害流行与药用植物病害研究室主任、辽宁省植物保护学会副理事长,中国植物保护学会理事，中国园艺学会小浆果分会常务理事，农业部农药登记田间药效成验杀菌剂项目技术负货人等。长期从事植物病理学教学和科研工作，研究方向为植物病害流行学和药用植物病理学。教学主讲本科生和研究生普通植物病理学、植物病害流行学、药用植物病理学、植物检疫学和有害生物风险分析等多门课程，主编全国普通高校“十一五”规划教材药用植物病理学h辽宁省农民技术员培训教材中草药栽培技术hM药用植物病虫害防治彩色图谱机小浆果病虫害防治原色图谱和北方药用植物痛虫害防治3等5部教材及专著，副主编及参编15部。培养博士和硕士研究生70余人。科研先后主持及参加省部各类科研课题30余项，发表学术论文20()余篇，主编及参编学术专著20部.研制了玉米主要叶部病杏流行动态和预测预警模型，对北方药用植物病虫害病原学和安全防控技术进行了较为深入系统研究，研制了药用植物病虫害防治网站，培养了大批不同层次专业人才，取得多项科研成果，获辽宁省科技进步二等奖2项、三等奖4项。参加了英国牛津大学举办的辽宁省高校重点学科带头人培训班，曾赴俄罗斯、英国、美国、加拿大和土耳其等国多所大学进行校际访问及学术交流。曾获沈阳市科教系统优秀共产党员、沈阳市“五一”劳动奖章、沈阳市劳动模范、辽宁省普通高校优秀教学成果等奖、教育部全国多媒体课件等奖、辽宁省首届普通高校精品课主讲教师、辽宁省普通高校首届教学名师奖、辽宁省普通高校专业带头人,辽宁省科技特派先进个人、辽宁省百千万人才工程百人层次、辽宁省优秀青年科技工作者、辽宁省专业技术岗位二级教授、农业部突出贡献中青年专家、全国优秀教师等称号。享受国务院政府特殊津贴。薛彩云，女，1982年9月出生，讲师，主要工作为两株的分高纯化。赵杰峰，男，1991年8月出生，硕士研究生，主要工作为病菌分子鉴定。刘璐，女，1992年9月出生，硕士研究生，主要工作为毒素提取。李元杰，男，1991年I1.月出生，硕士研究生，主要工作为病两分子鉴定。焦文莉，女，1993年I1.月出生，硕士研究生，主要工作为作用机制研究。徐梦雪，女,1993年3月出生，硕士研究生，主要工作为病原学研究。