以支架为载体的TRADD 基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用.docx

以支架为载体的TRADD基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用以支架为载体的TRADD基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用以支架为载体的TRADD基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用刘云杰，袁月，童珂雅，陈瑶，代剑华，周学谦，彭贵勇（400038重庆，第三军医高校西南医院全军消化病探讨所）摘要：目的本试验视察TRADD基因慢病毒涂层食管支架置入后，TRADD基因对犬食管良性狭窄粘膜的转染效果及对食管狭窄的的抑制作用。方法将15只试验犬随机平均分为试验组、比照组及空白组，采纳氢离广凝固器制作良性食管狭窄模型，分别置入GEp-TRADD基因慢病毒涂层带膜食管支架、GFP-慢病毒涂层食管支架、一般带膜食管支架，1周后视察支架脱落状况，并取出支架，2,3、4周胃镜下视察狭窄程度。4周后处死试验犬，对狭窄食管组织行病理、免疫荧光检查，分别采纳western-b1.ot方法检测TRADD蛋白在三组食管组织中的表达,同时检测co1.1.agenI、Co1.1.agenIIR-SMA三种蛋白在食管组织中表达状况。结果置入食管支架1周后，胃镜检杳见试验组试验犬带膜支架全部移位进入胃，比照组和空白组试验犬分别有2只、3只试验犬其带膜支架移位进入胃中，胃镜取出全部试验犬未移位食管支架。此后每周测量其食管狭窄处直径，nJ见比照组及空白组试验犬再次出现食管明显狭窄，而试验组再狭窄较轻。采纳重复测量设计的多因素方差分析，P0.01,具有统计学意义。食管狭窄组织HE染色切片表明空白组及比照组肉芽组织及纤维组织增生，而试验组肉芽组织及纤维组织增生较不明显。免疫荧光镜检查可见绿色荧光蛋白在黏膜下组织，表明TRADD基因慢病毒及慢病毒均在食管黏膜下生长。WeStern-b1.ot检测试脸组可检测GFP-Tradd-F1.ag蛋白，而空白组和比照组未检测出该蛋白，表明TRADD基因慢病毒胜利转染至食管黏膜下组织。western-b1.ot检测显示试验组co1.1.agenI-kco1.IagenIIk-SMA三种蛋白较其他两组明显降低，具有统计学差异。结论以支架作为载体可胜利将TRADD慢病毒转入食管粘膜组织中，可抑制狭窄部位组织增生，削减食管狭窄部位再狭窄发生。关键词TRADD；慢病毒；食管支架；食管良性狭窄；基金项目国家H然科学基金面上项目(81070384,81470907)通讯作者彭贵勇，电话：Te1.:(023)68765185,邮箱：pgy63163TheinhibitoryeffectoftransfectionofTRDDgene-expressingIentivirusesusingstentsascarriersinbenignesophagea1.stricture1.iuYunjie,YuanYue,TongKeya,ChenYao,DaiJianhua,ZhouXueqian,PengGuiyong(InstituteofGastroentero1.ogy,SouthwestHospita1.,ThirdMi1.itaryMedica1.University,Chongqing,400038).Abstract:ObjectiveThisstudyobservedtheeffectofTRADDgenetransfectioninthemucosaofbenignesophagea1.strictureindogsanditsinhibitoryeffectonesophagea1.strictureafteresophagea1.stentscoatedwithTRDDgene-expressingIentiviruseswereinsta1.1.ed.MethodsFifteenexperimenta1.dogswererandom1.yandeven1.ydividedintoexperimenta1.,contro1.,andb1.ankgroups.Bcnignesophagea1.stricturemode1.swereconstructedusingargonp1.asmacoagu1.ation(PC).Coveredesophagea1.stentscoatedwithGFP-TRADDgene-expressingIentiviruses,esophagea1.stentscoatedwithgreenf1.uorescenceprotein(GFP)-expressingIentiviruses,andregu1.arcoveredesophagea1.stentswerep1.acedintodogs,andtheconditionsofstent1.osswereobservedafteroneweek.Stentswereremoved,andthedegreesofstricturewereobservedusinggastroscopyafter2,3,and4weeks.Experimenta1.dogsweresacrificedafter4weeks,andpatho1.ogica1.andimmunof1.uorescenceexaminationswereperformedonesophagea1.stricturetissues.Westernb1.ottingwasperformedtodetectTRDD,co1.1.agenI,co1.1.agen111.,and-smoothmusc1.eactin(-SMA)proteinexpressioninesophagea1.tissuesinthethreegroups.Resu1.tsOneweekafteresophagea1.stentp1.acement,gastroscopyresu1.tsshowedthata1.1coveredstentsindogsintheexperimenta1.grouphadmigratedintothestomach,whi1.ecoveredstentsmigratedintothestomachinon1.y2and3dogsinthecontro1.andb1.ankgroups,respective1.y.Non-migratedesophagea1.stentsinexperimenta1.dogswereremovedbygastroscopy.Afterremova1.,thediametersofesophagea1.stricturesitesweremeasuredeveryweek.Significantesophagea1.strictureoccurredagaininexperimentdogsinthecontro1.andb1.ankgroups,whi1ethere-strictureintheexperimenta1.groupwasmi1.der.Repeatedmeasuresdesignedmu1.tivariateana1.ysisofvariancewasperformed,andPO.O1.indicatedstatistica1.significance.Hematoxy1.inandeosin(HE)stainingresu1.tsofesophagea1.stricturetissuesindicatedthathyperp1.asiaofgranu1.ationtissuesandfibroustissuesoccurredintheb1.ankandcontro1.groups,whi1.ehyperp1.asiaofgranu1.ationtissuesandfibroustissueswasnotobviousintheexperimenta1.group.ImmunofIuorescencemicroscopyrevea1.edGFPexpressioninsubmucosa1.tissues,indicatingthatTRADDgene-expressingIentivirusesandIentivirusesgrewinesophagea1.submucosa.Westernb1.otdetectionresu1.tsshowedthattheGFP-TRADD-F1.agproteincou1.dbedetectedintheexperimenta1.group,whi1.etheproteinwasnotdetectedintheb1.ankandcontro1.groups,indicatingthatTRADDgene-expressingIentivirusesweresuccessfu1.1.ytransfectedintoesophagea1.submucosa1.tissues.Westernb1.otresu1.tsshowedthattheco1.1.agenI,co1.IagenIII,and-SMproteinexpression1.eve1.sintheexperimenta1.groupweresignificant1.y1.owerthanthoseintheothertwogroups：thedifferenceswerestatistica1.1.ysignificant.Conc1.usionUsingstentsascarriersresu1.tedinsuccessfu1.transferofTRADD-CxpressingIentivirusesintoesophagea1.mucosa1.tissues,whichcou1.dinhibittissuehyperp1.asiaatstricturesitesandcou1ddecreasere-strictureofesophagea1.stricturesites.KeywordsTRADDi1.entivirusiesophagea1.Stentibenignesophagea1.strictureThisworkwassupportedbytheNationa1.Natura1.ScienceFoundationofChina(81070384,81470907).Correspondingauthor:PcngGuiyong,Te1.:862368765185,E-mai1.:pgy63163食管良性狭窄引起的吞咽困难临床较难解决，严峻影响患者生活质量，并且引起严峻并发症11.其治疗常采纳探条扩张或球囊扩张，但其复发率较高23目前对难治性良性食管狭窄治疗主要是安装食管支架。食管支架可显著改善患者吞咽困难等症状4。但是各食管支架仍有缺点：自扩张金属支架(se1.f-expandab1.emeta1.stents,SEMS)两端因金属成分对食管黏膜的刺激作用，常导致肉芽组织增生而引起再狭窄，肉芽组织常将支架包埋，当要移除金属支架时，可导致食管裂开50自扩张塑料支架(se1.f-expandab1.ep1.asticstents,SEPS)能削减反应性组织增生及增加支架移除平安性，但是其具有较高的支架移位率062%)及缓解乔咽困难的时间较短1»可汲取支架(biodcgrdab1.estentsBDS)允许支架被组织包埋及不须要取出，但由于寿命一般只有6周，不能有效支撑到8-12周以上,再狭窄发生率仍较高61.因此，目前对难治性良性食管狭窄还缺乏满足的治疗手段。食管良性狭窄主要是由于瘢痕增生所致。目前的探讨表明，细胞凋亡与瘢痕增生、搬痕疙瘩的形成具有亲密的关系。细胞凋亡表现为凋亡信号通路的表达，其最主要的传导途径为死亡受体(Death-receptor,DR介导的信号转导。目前已探讨的死亡受体包括TNFR1.,FS,DR3,DR4,DR5,DR6,NGFRandEDAR7,其中探讨最彻底的是TNFR1.其与配体-肿痛坏死因子受体相关死亡域蛋白(tumornecrosisfactorreceptorassociateddeathdomainprotein,TRADD)结合，通过肿瘤坏死因子-(tumornecrosisfactora1.pha,TNF-)介导的信号通路调控细胞的增殖与凋亡。在瘢痕组织中，TRADD的低表达，可能抑制了TNF-介导的细胞凋亡途径，导致增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophicSCarfibrob1.ast,HSFb）的过度增殖及病理性瘢痕的形成8我们前期探讨利用慢病毒载体系统胜利构建了携人TRADD基因过表达慢病毒，将其转染入HSFb后，可使HSFb中TRADD蛋白表达复原正常，可抑制HSFb的细胞增殖，影响细胞分裂，促进细胞凋亡，降低I型胶原蛋白的分泌,从而削减HS的形成9o因此，我们拟以氮离子凝固术构建试验犬食管狭窄模型，以全覆膜食管支架作为载体，将TRADD基因慢病毒转染入食管狭窄段组织，视察其抑制组织增生及防止再狭窄的效果。1 .材料与方法1.1.试脸动物成年健康毕格犬购自第三军医高校试验动物中心，并通过第三军医高校试验动物伦理委员会审查。试验犬体重15-20KG,雌雄不限，共15只，称量体重，编号，采纳随机数据表将其分为试验组（试验犬4、7、10、14、15号）、比照组（试验犬1、2、3、6、13号）和空白组（试验犬5、8、9、11、12号），每组各5只。试验组拟置入TRADD基因慢病毒涂层支架，比照组置入慢病毒涂层支架，空白组置入一般带膜支架。饲养于第三军医高校试验动物中心试验犬饲养室。1.2 病毒载体TRADD基因慢病毒过表达载体（210E8TU）及慢病毒过表达载P1.VX-EGFP-3F1.AG-PUro（210E8TID购自上海生博公司。1.3 器材带膜食管支架（中国济南德尔竺科技有限公司，JiNanDermanKeJiCo.1.td）,规格1.8cm8cm0GIG-Q260胃镜（日本奥林巴斯公司），APC300/ICC200EA型氨离子凝固器（德国ERBE公司），电泳仪、电泳槽（北京六一仪器厂），免疫荧光显微镜。1.4 主要试剂RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购H江苏碧云天生物科技探讨所。RabbitAnti-TRADD,Mouse-Anti-Co1.1.agenI、Co1.1.agenII1.RabbitAnti-SMA四种抗体均购自ABCOv公司。GoatAnti-rabbitIgG,Goatnti-mouseIgG购自中国中杉公司。1.5 食管良性狭窄动物模型的构建试验犬试验前一口夜间及建模当日禁食，建模前4h禁饮。术前30分钟试验犬肌注3%戊巴比妥钠注射液（30mgkg）.阿托品注射液IOmg0待试验犬深昏迷后，在胃镜引导下，在距门齿约30厘米处给与氮离子凝固器对食管黏膜表面环形烧灼（氮气功率70瓦，流量2升/分，作用时间3秒），烧灼至食管表而黏膜呈焦痂样。术后禁食1天。每周复查，对建模不志向的试验犬可再次给与氢离子凝固器烧灼（参数同前）。1.6 食管支架的安装及术后视察首先对食管狭窄处行球囊扩张，待胃镜恰可通过后即行食管支架的安装。选用带膜裸钛记忆食管支架，将GFp-TRADD基因过表达慢病毒610E8TU匀称涂抹于带膜食管支架表面，涂抹后马上在胃镜引导下安置于食管狭窄表面。同时空白组安装一般带膜银钛记忆支架，比照组安装慢病毒涂层食管支架。安装支架后第1周视察支架移位状况及食管狭窄的程度。经胃镜取出食管支架。术后第2周、第3周及第4周视察食管狭窄程度，同时视察试验犬进食状况及体重变更状况。1.7 试验犬食管标本提取安装支架4周后处死试验犬。戊巴比妥钠注射液麻醉试验犬至深昏迷，静脉注射10%氯化钾注射液IOm1,处死试验犬，逐层分别取出食管，切取食管狭窄部位。将该处组织分别为每块组织约为1Omm1.Omme1.8 组织HE检查分别取各试验犬食管狭窄段组织一块送至我院病理科医生行HE染色及病理检查。病理医生对试验结果采纳单盲的方法。1.9 免疫荧光视察分别取三组试验犬食管狭窄处食管组织，行冰冻切片，切片厚度为IOumo免疫荧光显微镜视察食管组织.以视察TRADD基因慢病毒过表达载体转染状况。1.10western-b1.ot检测食管组织转染Tradd基因慢病毒后TRADD-GFP-F1.ag融合蛋白的表达分别提取少许三组试验犬食管狭窄部位食管组织。取少许组织，加入200UIRIPA裂解液，匀浆器研磨至浆状，4'C100oOg离心5min,收集上清，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)变性电泳，继之半干法电转移法将蛋白印迹转移至PVDF膜上，5g脱脂奶粉于常温下封闭2h,TBS洗膜3次，每次10min<.加入一抗Mouse-Anti-O1.1.agenI、COIIagennI、RabbitAnti-SMA,4C孵育过夜,洗膜。加入二抗Goatnti-rabbitIgG、GoatAnti-mouseIgG,洗膜后以BCIP/NBT底物显色试剂盒显色。1. 11western-b1.ot检测二组食管狭窄部位组织中co1.IagenICo1.1.agen1.1.1.,-SMA三种蛋白表达。分别取三组试验犬食管狭窄部位少许组织，加入200uIRIPA裂解液，匀浆器研磨至浆状，4C10000g离心5min,收集上清，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)变性电泳，继之半干法电转移法将蛋白印迹转移至PVDF膜上，5g脱脂奶粉于常温下封闭2h,TBS洗膜3次，每次10min。加入一抗Rabbitnti-TRDD,4C孵育过夜,洗膜。加入二抗GOatAnti-rabbitIgG,洗膜后以BC1.P/NBT底物显色试剂盒显色，天能凝胶成象分析系统扫描条带并分析。以GAPDH作为内参,计算相对值。试验重复3次。1.12统计学分析:对试验犬食管狭窄处内径数据采纳SPSS13.O进行重复测量设计的多因素方差分析，PVO05表示具有统计学意义。2结果：2.1食管狭窄及支架安装模型的构建结果鼠离子凝固器灼伤食管，食管表明呈焦痂样（图D。图IAPC烧灼试验犬食管A.运用APC对试验犬食管进行烧灼；B.APC烧灼食管后胃镜下表现4周后三组试验犬食管均出现明显狭窄，符合食管支架安装标准（图2A）。建模前测量试验犬食管狭窄部位直径（表1）,以活检钳钳夹张开的宽度07Cm作为参考，测量食管直径。安装食管支架如图2B所示。图2带膜食管支架置入前后A.胃镜下视察试验犬食管，可见试验犬食管明显狭窄，狭窄处管径仅0.4cm；B.胃镜引导下行带膜食管支架安装2.2胃镜下试验犬食管狭窄部位视察及测量术后第1周视察，可见试验组试验犬食管支架全部移位进入胃中，比照组试验犬1号、6号及空白组试验犬5号、8号、11号支架移位进入胃中。同时将支架未移位试验犬的食管支架取出。术后第2周、第3周、第4周视察，比照组及空臼组较试验组比较，试验犬进食明显受限，进食出现呃逆、哽噎状况，体重减轻明显,而试验组在取出支架后无明显呃逆及哽噎状况，进食不受限，体重减轻不明显。从其次周起先测量试验犬食管置入支架部位的内径，以活检钳钳夹张开的宽度0.7C1.n为参照，测量试验犬狭窄部位最狭窄处宽度，三组试验犬食管狭窄处胃镜视察如图3所示，宽度均数及标准差如表1所示，试验犬食管狭窄段直径变更如图4所示，显示试验组较比照组和空白组明显狭窄程度轻，对试验犬食管狭窄处宽度数据采纳SPSS13.0进行重复测量设计的多因素方差分析，以造模前食管直径为协变量，结果显示PV001,表明试验组与比照组和空白组比较，食管狭窄段内径差异明显，具有统计学意义，说明试验组食管狭窄明显较其余两组轻。图3置入支架第4周试验犬胃镜图片A试验组15号犬第4周食管胃镜图片，可见食管直径直径约1.8cm,表面光滑，略狭窄：B比照组3号试验犬胃镜图片，直径约0.8cm,表面糜烂，中等狭窄程度；C空白组12号试验犬胃镜图片，直径约0.6cm,表面充血，明显狭窄。犬食管狭窄宽度均数及标准差（Cm）（表1）分组造模前其次周第三周第四周试验组均数2.762.182.061.94标准差0.090.130.130.09比照组均数2.761.861.240.96标准差0.110.090.260.26空白组均数2.781.821.320.92标准差0.080.180.180.23图4犬食管狭窄段直径变更折线图2.2三组试验犬食管狭窄部位组织切片视察。分别取三组试验犬食管组织，进行HE染色。试验组试验犬食管组织切片，可见食管轻度纤维组织增生。比照组及空臼组试验犬食管组织，可见肉芽组织增生，纤维组织增生明显，炎性细胞浸润，伴表面溃疡形成（图4）o图4试验犬食管狭窄组织切片A试验组试验犬食管组织切片。B组和C组分别为比照组及空白组试验犬食管组织。2.3三组试验犬食管狭窄部位切片免疫荧光视察。试验组及比照组均可见食管黏膜下组织见绿色荧光蛋白，而空白组无绿色荧光蛋白，表明GFP-慢病毒及GFP-Tradd基因慢病毒均能在食管黏膜下组织生长（图5）。表明慢病毒涂层支架能有效转移慢病毒至食管组织，并且在黏膜下组织有效表达。图5试验犬食管组织免疫荧光图试验组免疫荧光图，B比照组免疫荧光图,C空白组免疫荧光图2.4western-b1.ot检测食管组织转染Tradd基因慢病毒后TRADD-GIT-F1.ag融合蛋白的表达。以一ACtin为内为蛋白,PrestainedProtein1.adder为marker,试验组可在55-72KDa处视察到阳性条带，具大小和TRADD-GFP-F1.ag融合蛋白（34KDa+28KDa+2KDa=64KDa）相吻合。表明试验组Tradd基因慢病毒胜利转染食管林膜下组织（图6)图6norma1.：空白组，contro1.1.enti：比照组，tradd1.enti：试验组。2 .5WeStern-b1.ot检测三组食管狭窄部位组织中COIIagenI、Co1.1.agenHk-SMA三种蛋白表达（图7）以三种目的蛋白与GAPDH内参蛋白累计光密度的比值作为三种蛋白的相对比较量,绘制柱状图，结果显示COneganI,Co1.1.eganIIk-SMA三组蛋白均表现出试验组较空白组、比照组明显降低，且具有统计学意义，P<0.05（*表示P值小于0.05）（图7）。三种蛋臼空白组、比照组之间无明显差异。试验表明Tradd基因慢病毒能有效促进成纤维细胞凋亡，导致上述三种蛋白量明显降低，表明其在食管狭窄处能抑制再狭窄的发生。图7左图为western-bit结果，右侧为B1.ank为空白组，Contro1.1.enti为比照组，TRADD1.enti为试验组。以GAPDH为内参蛋白。PreStainedProtein1.adder为marker<>右侧为以三种目的蛋白与GAPDH内参蛋白累计光密度的比值作为三种蛋臼的相对比较量而绘制的柱状图。3 .探讨目前以冠脉支架为运载体系将药物及特异性基因带到血管狭窄段治疗血管狭窄取得了较好的效果。SharifF以腺病毒为载体，以蛋白涂层支架为介导，转染1.arc基因至新西兰兔骼外动脉，结果显示转染效率高，能预防血管腔内再狭窄10。WangK和Kess1.erPD以重组腺病毒为载体，同样以血管支架为介导，携带人诱生型一氧化氮合酶(HUmaninducib1.enitricoxidesynthase,AdiNOS)基因，转染至试验猪血管，显示能降低新生血管内皮增生，降低再狭窄率11。可见，通过病毒为载体，将目的基因转染至局部血管壁，实现外源性基因表达，可最大限度地在血管局部发挥生物学效应，对血管内再狭窄进行基因治疗已取得肯定效果口2。目前以食管支架为载体携带药物治疗食管狭窄的探讨较少，S.R.Jeon采纳紫杉醉药物涂层食管支架应用于动物支架，试验表明药物能显著缓解动物食管支架引起的食管肉芽组织增生5o但药物洗脱支架的疗效与其作用时间长短有明显关系，因此，它受药物释放度影响较大。目前缺少基因涂层食管支架的探讨。我们首次运用TRADD基因慢病毒涂层支架，以支架为载体将TRADD基因慢病毒胜利转染至食管良性狭窄段组织中。胃镜检查TRADD基因慢病毒涂层支架组试验犬食管再狭窄程度较比照组和空白组明显轻，且具有统计学意义；免疫荧光检查已证明其能转染至食管黏膜下组织并有效表达，*estern-b1.ot试验检测可见TRADD-GFP-F1.ag融合蛋白在试验组表达，而在比照组和空白组则未检测出该融合蛋白：western-b1.ot同时检测COIIeganI、CO1.1.egan1.1.1.-SMA三组蛋白在试验组较空白组和比照组比较明显降低，且具有统计学差异。以上结果说明以食管支架作为载体携带TRADD基因慢病毒至食管良性狭窄段，能胜利将TRADD基因慢病毒转染至食管狭窄段黏膜下组织，可抑制狭窄部位组织增生，削减食管狭窄部位再狭窄发生。我们认为，在狭窄食管扩张和安装支架的过程中，食管黏膜损伤可让慢病毒进入食管黏膜下组织，同时在黏膜下组织中生长并表达，支架能维持在食管狭窄处数天，可有效使TRADD基因慢病毒持续进入食管黏膜下组织。在试验过程中，试验组支架全部移位，比照组和空白组分别有2只、3只支架脱落，我们考虑这与带膜支架本身较高的移位率有关，试验组1周后支架全部移位，可能还与TRADD基因转染后抑制成纤维细胞增生，减轻了狭窄程度有关。TRADD可通过TNF-介导的信号通路调控细胞的增殖与凋亡，TRADf）在病理性瘢痕成纤维细胞中的低表达，可能抑制了TW-介导的细胞凋亡途径，导致HSEb的过度增殖及病理性瘢痕的形成8o其中，TRADD与TNFR1.的结合是TW/TNFR1.介导的细胞凋亡信号转导通路中公认的重要步骤。探讨表明，TRADD是成纤维细胞膜TNFR1.及TRIF依里的To1.1.样受体介导的细胞凋亡信号通路中必需的信使分子13。在瘢痕的形成过程中，TNF-对成纤维细胞胶原合成有着重要影响14»一般状况下，机体内的成纤维细胞产生的胶原蛋白处于动态平衡状态，即合成代谢与分解代谢相当，但是在某些因素的诱导或条件变更的过程中，这种动态平衡被打破，导致成纤维细胞的胶原合成明显大于其分解，最终导致以I、川胶原纤维和-SM(-平滑肌肌动蛋白)的过度增生，从而沉积于组织间隙中而发生纤维化，这是纤维化的细胞学基础15.本试验也证明提高疤痕组织中TRADD基因表达能有效抑制纤维化的发生，从而能抑制食管瘢痕组织形成。慢病毒(1.entiVirUS)载体是以人类免疫缺陷病毒7(HIV-I)为来源的一种病毒载体，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成16,主要表现在感染效率高、表达稳定、自身抗原性弱、可操控性强以及容纳外源目的基因片段大等方面。慢病毒载体最大的优势在于不仅能转染进入分裂期的细胞，而且能转染未分裂细胞及不分裂的细胞。目的基因搭载慢病毒载体进入靶细胞基因组中，能够长期稳定的表达17慢病毒载体仍存在一些平安性方面的问题。慢病毒载体是一种逆转录病毒载体，将目的基因插入靶细胞基因组中，是致突变性的，这样就有可能对宿主基因造成不行逆的变更。尤其是是插入某些特别的部位或关键的部位，就可能会引起插入突变或者激活某些致病基因，引起宿主新的病变18。尽管如此，慢病毒载体已成为当前基因转移载体探讨的热点。我们已利用慢病毒载体系统胜利构建了TRADD基因过表达慢病毒，并且胜利转染至动物食管组织中，其平安性还有待进一步探讨90但是目前的试验仍旧是初步的。现在我们仅简洁的将TRADD基因慢病毒采纳物理的方法涂抹于带膜食管支架表面，须要即时涂层即时安装。下一步拟采纳更有效的方法，比如采纳生物蛋白胶(Fibring1.ue)与TRADD基因慢病毒混合，然后将其涂于食管损伤段，让TRADD基因慢病毒缓慢释放。同时对慢病毒在试验犬各组织、脏器的分伤及其平安性应进一步探讨。参考文献1.YoungHeeHam,GwangUaKim.P1.asticandBiodegradab1.eStentsForComp1.exandRefractoryBenignEsophagea1.Strictures.C1.inEndosc,2014:47:295-3002.ShahJN.Bcnignrefractoryesophagea1.strictures:wideningtheendoscopistsro1.e.GastrointestEndosc2006;63:1641673.1.ewRJ,KochmanM1.Areviewofendoscopicmethodsofesophagea1.di1.ation.JC1.inGastroentero1.2002：35:1171264.HirdesMM,V1.eggaarFP,SierscmaPD.Stentp1.acementforesopha-gea1.strictures:anupdate.ExpertRevMedDevices2011:8:733-755.5.S.R.Jeon,S.H.Eun,etc.Effectofdrug-e1.utingmeta1.stentsinbenignesophagea1.stricture:aninvivoanima1.study.Endoscopy2009;41:449-4566.Vandenp1.asY.degradab1.eesophagea1.stentinthetreatmentofacorrosiveesophagea1.stenosisinachi1.d.Endoscopy.2009;41:E737.Ye1.ena1.Pobezinskaya,Zhenggang1.iuThe.ro1.eofTRDDindeathreceptorsigna1.ing.Ce1.1.Cyc1e11:5,871-8768.SayahDN,SooC,ShawWW,eta1.Downregu1.ationofapoptosis-re1.atedgenesinke1.oidtissues.JSurgRes.1999,87(2):209-216.9.YuanY,PengGY,1.iuYJ,eta1.1.entivira1.vectormediatedhumanTRADDgeneexpressiontopreventhypertrophicscar,expBio1.Med10.SharifF,hynesSO,eta1.Gene-e1.utingStentrconiparisonofadenovira1.andadeno-aSSoCiatCdvira1.de1.iverytotheb1.oodvesse1.wa1.1.invivo.HumGeneTher.2006Ju1.;17(7):741-75011.WangK,Kess1.erPD,eta1.1.oca1.adenovira1-mediatedinducib1.enitricoxidesynthasegenetransferinhibitsneointima1.formationintheporcinecoronarystentedmode1.Mo1.Ther.2003May:7(5Pt.1):597-60312.HongshanZhong,OsamuMatsui,KcXuMD1TakahiroOgi,Jun-ichiroSanada,YasuoOkamoto,YasuhikoTabata,YohTakuwa.Genetransductionintoaorticwa1.1.usingp1.asmid-1.oadedcationizedge1.atinhydroge1.-coatedpo1.yesterstentgraft.Journa1.ofVascu1.arSurgery.2009,50(6):1433-144313.PobczinskayaY1.,KimYS,ChoksiS,eta1.ThefunctionofTRDDinsigna1.ingthroughtumornecrosisfactorreceptor1andTR1.F-dependentTo1.1.-Iikereceptors.NatImmuno,2008,9(9):1047-1054.14.RoyceDE,ThomasA,HartJ,eta1.Hya1.uronicacidinducestumornecrosisfactor-a1.phaproductionbyhumanmacrophagesinvitro.BrJP1.astSrug,1997,50:362-36815.TanRJ1FattmanC1.,Niehouse1.M,eta1.MatrixMeta1.1.oproteinasesPromoteInf1.ammationandFibrosisinASbeS1.os-induced1.ungInjuryinMice.mJRespirCe1.1.Mo1.Bio1.,2006,Vo1.35(3):289-29716.WiznerowiczM,TronoD,eta1.HarnessingHIVfortherapy,basicresearchandbiotechno1.ogy.TrendsBiotechno1.,2005,23(1):42-47.17.Cockre1.1.AS»KafriT.Genede1.iverybyIentivirusvectors.Mo1.Biotechno1.2007,36(3)：184204.18.HargrovePW,KcpesS,HanawaH,eta1.G1.obinIentivira1.vectorinsectionscanperturbtheexpressionofe11dogeousgenesinbeta-tha1.assemichematopoieticce1.1.s.Mo1Ther,2008,16(3):525-533.