免疫分型教程.docx

4O一免疫分型教程正常骨髓免疫分型O1.c<nIo1.O1.81.兴。京上图是正常骨髓经CD45、CD71、CD33染色后组成的CD45/SSC.CD71/CD33双参数散点图；通过这两个组合，能够辨别骨髓的正常细胞、检查是否有异样细胞存在、评估细胞的成熟状况。CD45/SSC图中可见：1. CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞（褐色细胞群体）；2. 中等强度的CD45表达,SSC信号最强的细胞群体为粒细胞（蓝色与红色细胞群体）；3. CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体（绿色细胞群体）；4. CD45阴性，SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片；CD33/CD71图中可见：1 .CD33表达最强的单核细胞群体（绿色）；2 .粒细胞CD33表达较单核弱,不成熟粒表达CD71.成熟后不表达。3 .淋巴细胞、有核细胞和细胞碎片不表达CD33、CD71oCD11B/CD15图可用来评估髓系细胞向单核、粒分化的程度（随着髓细胞成熟，细胞逐步获得CD1.1.B,粒细胞高表达CD15）:1,单核细胞（绿色）高表达CD1.1.B.CD15中等到表达；4 .粒细胞（蓝色与橘红色）高表达CD15,蓝色成熟粒CD1.1.B表达较橘红色不成熟粒细胞强,无趣髓细胞仅表达CD15而无CD11B。5 .T、B淋巴细胞不表达CDI5、CD1.1.B,NK细胞表达CDIIB而无CD15(红色细胞)。4,有核红细胞与碎片不表达CD15和CD11B。依据骨髓细胞CD45/SSC图中分布状况设门圈定各类细胞：R1.门为成熟淋巴细胞；R2门为正常单核细胞位置；R3门正常粒细胞位置；R4门为无趣淋巴细胞出现位芭；R5门为有核红细胞或细胞碎片位置；R6门为无趣筋细胞出现位置；白血病细胞通常会在R4、R6两门位置处出现。MO免疫分型M0:急性髓细胞白血病微分化型原始细胞在光镜下类似1.2型细胞核仁明显.胞浆透亮.嗜碱性,无嗜天青颗粒与AUer小体.髓过氧化酶(MPO)与苏丹黑B阳性细胞3马;电镜下,MPO(+)CD33或CD13等髓系标记可呈(+),淋巴系抗原通常为(一),但有时CD7+,TdT+部分急非淋白血病可表现CD7+,TdTo形态学：无趣细胞占骨健有核细胞9佻以上；肿瘤细胞不出现AUER小体；粒细胞缺少，MPo或苏单黑染色阴性。遗传学：染色体常有困难的异样，特殊是5和7号染色体。当病例伴T（9；22）时会出现淋系抗原。无趣细胞群体的FS和SS信号低.在CD45/SS点图中特征性地与无趣淋巴细胞区域相连。无趣细胞至少表达一种骨髓抗原：CD13.CD33,但完全缺乏髓系成熟分化抗原：CD1.IB.CD15和CDI6。相当一部分病例TDT阳性，但在肿瘤细胞上分布不均。肿癌细胞通常淋系抗原阴性，但有时也会表达CD7或CD4；H1.A-DR通常阳性，CD34则为阴性。有学者指出伴CD7和CD34同时表达的病人预后不佳。检测胞浆内MPO比CD33/CD13联合检测更为敏感。Mo中MPo阳性率一般小于3虬如大于3%则要判定为M1.。M0:H1.A-DR+,CD34+,CD13+A,MP0+,CD14-,CD1.1.b-,TdT-+to+/-H1.ADRC01302CD34CD3X>骨髓样本类似纯化的培育细胞，在CD45/SSC图中可见到数量占绝大多数的一群无趣细胞群体。这群异样细胞在的SSC信号较低，大小中等。无趣细胞CDI9、CD34阴性，但同时表达CD13和CD330CD13表达稍弱，且抗原表达较CD33不均一。白血病细胞占了全部细胞群体的96&H1.A-DR在这些健系细胞上不表达。这些无趣细胞表型的状况是：CD13阳性,CD33阳性,CD34阴性，H1.A-DR阴性。这个表型与AM1.-M3相以CIO0IO1IO2100!0410o10110?IO3IO4CDSIgG-CTR1.肿瘤细胞不表达CD71、CD117.CD18,CD1.1.b和CD1.5。CD64是阴性,但CD14表达。CD14表达强度比较弱与CD13相像。T细胞标记物CD2、CD5、CD3和CD7都不表达。在图中可视察到残存的一些T细胞。与阴性比照相比，CD4弱阳性表达。诊断：AM1.微分化型，CD34和H1.A-DR阴性。试验室进一步诊断:MPo(免疫组化)阳性,NSE阴性,46XY.t(3;5)(q25:q34)重要说明：本例中白血病细胞免型表型为：CD34-、H1.A-DR-.CD13+,CD33+.表面看与AM1.-M3相像。在很多无趣细胞胞浆内存在的颗粒会导致AM1.-M3的误诊。但FCM的数据供应了一些有价值的信息避开这个错误。详细总结如下：(1)表达CD14(克隆号IeU-M3),尽管表达有所降低；(2)SSC信号降低并且相对分散。这一点非常重要,因为AM1.-M3v的SSC信号比较集中,甚至M3v细胞中带有颗粒。另一重要信息是CD13表达下降甚至缺失而CD33强阳性（一种异样的CD13/CD33表达模式）。有时AM1.-M3可能会缺失表达CD13对于这些疑难病例须要借助分子遗传学和细胞遗传学诊断工具来建立正确的诊断。CD3FCCD38HTC10101(10'15FCG1.YFITC1011TD喏TC1°31°47FITC其他标记物如：Bce1.1.s（CD19,CD20,Kappa11.ambda）,CD1.O（CaIIa）,CD5（Tce1.1.s）,CD41（PIaIe1.et）都是阴性。光散射图中显示在前向散射光和表示颗粒度的侧向散射光有一群处于中间位置的细胞。这与组织学检测结果相一样。（暂无图）将光散射图中的异样细胞放置于CD45/CD14上显示发觉CD45阳性并CD14阴性（99%）。CD45表达强度低于成熟淋巴细胞，可能是由髓系细胞和未成熟无趣细胞组成。（暂无图）在H1.ADR/CD3等高图中发觉其中大部分DR阳性（81%）并且CD3阴性（T细胞受体）0这个表型可见于活化的T细胞和成熟B细胞（CD45强阳性）。DR表达于绝大多数髓系细胞、B细胞和活化的T细胞。CD34/CD38图中显示细胞CD34阴性并且CD38阳性。CD38可见到浆细胞、前B细胞、单核细胞、A1.1.细胞和绝大多数AM1.细胞。此处可排队浆细胞的可能性（CD45阴性），前B细胞还无法解除.单核细胞可解除（CD14阴性）。CD13/CD15等高图中显示大部分细胞（63）随系抗原CD13/CD15阴性。但此处供应了一丝线索，因为有些细胞（30表达低水平CD1.5。绝大部分AM1.M1-M6细胞同时表达CD13和CD1.5。从CD33"dT图中可以确定这些细胞源自髓系（CD33阳性）。无细胞表达TdT。这表明这些细胞是处于极早期的髓系细胞，可能AM1.-MO/M1。CDI1.b/GPA双参数图中也证明了这些细胞早期髓系的属性。GPA在这些细胞上弱表达。这种状况可见于早期系干细胞CCDI1.b可见于单核细胞、粒细胞，NK细胞不表达此抗原。这些细胞还同时表达CD7。这使人感觉有误，但现已知早期越系白血病细胞可偶然同时表达CD7。将这些结果综合来看支持MO或M1.的诊断。要用流式细胞仪来区分MO和M1.现还有困难,所以还要结合组织学检测的结论,如发觉有MPo阳性则支持M1.,如阴性则为M0。M1.免疫分型无趣细胞成群，RA1.S信号弱。M1.与MO很难区分,但M1.细胞大小与颗粒度较MO稍大，与原粒细胞接近。至少伴随一种髓系抗原：CD13或CD33o高表达H1.A-DR,CD34阳性但较MO弱,>3%的无趣细胞表达MPO,较Mo多。coi5ncXH2sg二8不表达CD1.IB,CD15,CD16等。M1.XD1.1.B+,H1.A-DR+,CD13+,CD33+,CD34+,CD14+1MPO+,TdT+to+/-M2免疫分型C8CtHSFfRCPFSGHetJMCD45RA1.S图中细胞分布广泛与M1.不同，这是因为M2细胞已进一步分化无趣细胞削减，粒细胞赠多并与B1.ASTW1.NDOWS区域内细胞相连。因细胞没有明显分群,很难将异样细胞与正常相区分，故设立多个门进行分析检测其成熟度抗原的表达状况。M2免疫表型与MI类似，H1.A-DR1CD33,CD13阳性。上图中可见无趣细胞CD33与CD71表达均比成熟粒细胞强。CD13表达强于CD330M2肿瘤细胞弱表达CD15与CDI1.B,说明细胞已分化。CD34表达显著降低。M2肿瘤细胞不表达CD5,CD7和TdT等抗原，如病例伴1(8:21),则常常表达CD19偶表达CD56。一般肿瘤细胞MPo强阳性。偶见形态为M2并伴但CD13-,CD33-,CD14-,而MPO+。细胞分布广泛，无趣细胞较M1.少。CD13和CD33阳性,且CD13表达高于CD33。.0*CO-Co-O-3d<1=8H1.ADR阳性，CD15弱阳性。叁-1.'C>FTCM2肿瘤细胞伴t（8,21）CD19阳性。M3免疫分型上图为M3V,少颗粒型早幼粒白血病细胞.细胞中颗粒少RA1.S信号低而集中.SS座标上出现大量肿瘤细胞。肿瘤细胞大，FS信号强°通过CD45/RA1.S双参图可辨别出M3与M3Vo下为经典M3多颗粒细胞的CD45/RA1.S和SS/FS图.Ja=BOSpOOO1.00800900寸00。0saopM3与M3V在免疫表型上无区分。M3肿瘤细胞特征性地不表达髓系早期标记物CD34和H1.A-DR；部分病例中CD9特征性地阳性，但不是完全特异。CD2在M3与M3V中会出阳性表达，在H1.A-DR阴性的病例中，与染色体1(15,17)异样相关。o'ao,o4CW4(MY4y11Co,oxio,iCWSFfTCCO1.>-O1.Sff1.-Sv肿瘤细胞CD33表达比正常粒细胞强与正常单核细胞相像，CD13表达多样。肿瘤细胞不表达晚期髓细胞分化抗原CD15.CD16和CDIIB。肿施细胞完全不表达CD15,与正常早幼粒细胞表达CD15相区分；正常早幼粒细胞细胞周期中含高比例S期细胞,而肿瘤细胞中几乎不见细胞周期，1(io1io*io3wffcccAS>O-&1.XH2弦4舌一crio1o2io,oCo1.oFITCO-b1.Ho-O-S66肿瘤细胞MPO阳性，上图中MPO与1.actoferin双染来区分成熟粒细胞。肿瘤细胞除表达CD2外，很少表达T或B系抗原。io,o2o,10tio*Hio1.O4K)G1.11TCCYTC41S2IGo1.HTCM3肿瘤细胞因其胞浆内多颗粒，细胞具有很误的自发荧光CM3:CD33+,CD13+,MPO+,CD34-,H1.A-DR-,CD1.1.b-,CD14-,CD15-,TdT-M4免疫分型8：典型的M4病例CD45/RA1.S图中会出现一群异样的单核细胞和一群骨髓无趣细胞.肿瘤细胞较MO,M1.细胞的FS和SS信号增加。有时这两群细胞会相互叠加占据B1.ASTWINDOWS和成熟单核细胞位置,故难圈出独立成群的肿瘤细胞。对于M4病例一般都设多个门对异样细胞进行分析.且每个异样细胞群依据其成熟度的不同，表型也可能互不相同。本例为M4EO.增多的嗜酸细胞RA1.S信号与早幼粒相像CD45信号与单核细胞相像，本例中为R4门中紫色细胞。10,oio,87meonorO1.O”S5.2io4SICr0o,oa8MFnC无趣细胞群表达CD34,H1.A-DR.而异样单核细胞则CD34阴性,H1.A-DR阳性。无趣细胞CD33阳性，CD14阴性，而异样单核细胞则为CD33阳性,CD14.CD64阳性。CD64表达如象本图中强阳性表达则为单核细胞特异性标记。M4肿瘤细胞在CD11B/CD15图中会特征性分布如上，存在无趣细胞与各期的粒细胞与单核细胞。CD2表达与M4E0有很大相关性，可能与16号染色体异样有关。M4b1.astpopu1.ation:CD13+,CD33+,CD34+,H1.ADR+,CD1.1.b-,CD14-M4abnoma1.monocyticce1.kCD13+,CD33+,CD34-,H1.A-DR+,CD1.1.b+,CD14+-,CD4+/-M5免疫分型§IM5肿瘤细胞从细胞大小、颗粒度和CD45表达都向成熟单核细胞过渡，形成一大细胞群体。M5分为二个亚型M5a和M5b,前者细胞稍大，与成熟单相比CD45表达弱但不独立成群。871FTTC34FfTCCO45PERCP814FCTC815FnCO"CeHZ0"os-O4110'IO2834EC髓系细胞的分化状况可从CD15/CD11B双参数图中视察,本例中肿瘤细胞CD15较平常高但低于右上角黑色的粒细胞.不成熟的单核细胞CDIIB表达弱.如出现CD33阳性，CD13,CD34阴性。M5肿瘤细胞通常高表达CD33,CD13表达多样。CD4是髓系无趣细胞向单核系分化的敏感指标。CD14一般表达在成熟单核细胞上,本例中肿瘤细胞CD14阴性，CD64阳性。AMM1.病例中，CD64在单核细胞上表达特殊强。本例中CD61弱阳性,这种状况是由于无趣细胞与血小板粘附造成的。M5a:H1.A-DR+,CD1.1.b+/-,CD34+,CD33+,CD13+,CD14+,CD4+/-M5b:H1.A-DR+,CD1.1.b+,CD34-,CD13+,CD16+-,CD14+,CD4+/-本例中可见两群无趣细胞，M6的定义是红系祖细胞占骨髓无趣细胞群体的50%强，而其他系别的无趣细胞可占30%以上。固诊断M6时要依据形态学红系细胞的数量来确定，如仅依据免疫分型很难得出正确诊断，必需结合形态计数无趣细胞数量来确定。以上是典型的M6免疫分型图，出现两群无趣细胞。肿瘤细胞可通过CD71强阳性表达加以确认，在一些红细胞稍成熟病例中血型精白A阳性。H1.A-DR1CD34和CD33或CD13通常阳性。OZcHo3-O41很多M6病例中会出现一群髓系无趣细胞，如本例中的红色细胞群体，M6jCD71+,GP-A+,CD34+-1H1.A-DR+-1CD13+-,CD33+-1CD34+-,CD14-,CD1.1.b-本例中无趣细胞CD45/RA1.S信号都不强。与B-A1.1.,M6的肿瘤细胞相像。(X61FnCCo1.zO1.星专VH87FnC0*10*1Oj1O,O4<071ATCio'o2o,CDMATCM7肿瘤细胞表达CD61和CD41.髓系抗原表达多样。成熟血小板粘附地白细胞也会表达CD41和CD61,这时会对诊断产生影响,此时要加做CD62来确认是否为成熟血小板粘附造成CD41或CD61阳性。Cr本例CD34阳性，CD71弱阳.其他系别抗原不表达C其他系别抗原均为阴性，与MO、M1.相像。M7:H1.A-DR+1CD34+,CD33+/-.CD14-.MPO-.TdT-TA1.1.免疫分型T-A1.1.的肿瘤细胞CD45表达较B-A1.1.细胞强,肿瘤细胞在CD45/SSC图中可能会出现在B1.ASTWINDOWS或单核细胞区或与正常淋巴细场胞相混。本例中肿瘤细胞CD1.O阳性.约三分之一的T-A1.1.会出现该现象,但CD19确定阴性。本例CD34阳性，约40%的T-A1.1.的肿瘤细胞CD34阳性，与细胞是否表达原始或成熟表型无关。T-A1.1.肿瘤细胞表面CD3常常阴性,但如用PE标记的CD3抗体则常常能检测到弱阳性。CD3/CD5双参数图中，肿瘤细胞总出现在正常T细胞以外的位置上,上图中黑色阳性颗粒为正常T细胞,肿瘤细胞CD4/CD8表达多样化,但是总与正常T细胞的表达不两只,如发觉CD4/CD8双阳性则提示为T-A1.1.o87RTCT-A1.1.最敏感的指标是CD7.但其特异不强有近30%的AM1.同样阳性。当CD7与H1.A-DR联用时其特异性增加，很多T-A1.1.特殊是在儿童，CD7强阳性而不表达H1.A-DR1而在AM1.中CD7弱表达并伴H1.A-DR阳性。T-A1.1.因与T细胞的成熟度相关，可被分为三期：pre-thymic：CD7+,CD1.a-,CD48-,CD3-；thymicCD7+,CD48+,CD3-；matrue:CD3+,CD1.a-;原始T细胞A1.1.与AM1.很难区分，要加洌J胞浆内CD3。T-A1.1.最常见的表型是：CD2,CD5,CD7,CD1.,CD4/8双阳性，CD3弱阳性，TdT强阳性。次其次为：CD2,CD5,CD7和TdT强阳性.再次为：CD2,CD5,CD7伴CD4或CD8部分表达，CD3表达少并少量表达TdT.T-A1.1.的共同特征是：下调表达T系抗原或出现异样抗原的联合表达。ba1.1.免疫分型急性B淋巴细胞性白血病可大致分为早前B-A1.1.1前B-A1.1.和成熟B-A1.1.1区分他们的依据是免疫球蛋白的表达与其表达位置。详细状况如下：1,成熟B细胞A1.1.表达表面免疫球蛋白(s1.g)2,前B细胞A1.1.细胞胞浆内表达免疫球蛋白重链(CU)而不表达轻链3,早前B-A1.1.则两者都阴性然而上述状况在用于诊断B淋巴细胞性白血病时常出现混淆。因为胞浆内免疫球蛋白重链CU在诊断过程中很少被检测，从而那些表面Ig阴性的病例全都被归于前B-A1.1.e早前B细胞型(B-precrsororear1.ypre-B)占儿童急淋的65%左右，占成人的50%左右。白血病细胞，依据形态对应FAB的1.1.或1.2型,处于B细胞成长的最原始阶断。细胞小而无颗粒，流式细胞分析期细胞的前向和侧向光信号很弱；特异性地,其细胞表面或胞浆内不表达免疫球蛋白。白血病细胞通常至少部分地表达干祖细胞抗原CD34和不成熟淋巴细胞抗原H1.A-DR或TdT。另外,少数罕见病例会同时表达CDIO和B细胞相关抗原CD19。其他在早前B细胞型白血病细胞上表达的B细胞抗原有CD9,CD22和CD24；这些抗原通常在B细胞成熟的中晚期才表达。CD20也是一具有广泛意义的抗原，但它的表达变异很大，会常常出现CD20阴性的细胞；这种混合型表达CD20与以CD20集中地、高表达的成熟B细胞有很大的区分。早前B白血病细胞的免疫表型与正常原B细胞很相像，但白血病细胞抗原的异样表达常会出现：同时异样地表达早期和成熟抗原,异样地抗原交叉表达(特殊为髓系抗原,或最常见的为抗原表达的强度改变。在儿童A1.1.中,早前B细胞白血病的免疫分型与疾病预后有很大的相关性.除CD1.O阴性的肿瘤特殊是婴儿，其预后一般较好。婴儿CD1.O阴性的白血病事实上常常会出现染色体1.1.q23异样,从而导致M1.1.基因重排，预后差。其他U1.q23异样的白血病”可出现的免疫表型包括表达般系抗原CD15并失去抗原CD24。白血病细胞通常会表达CD34和其他一些髓系抗原,但表达状况多变。除表达髓系抗原外，细胞还会强表达B系抗原CDI九其他一些预后比较差的如t(9;22)并由此而形成BCR-AB1.融合基因病例,这种状况多见于成人A1.1.,而儿童相对少见，由引可说明为什么成人A1.1.的预后较儿童的差。PhI染色体阳性的病例常常会表达髓系抗原，这与CD34、CD1.O.CD19和CD25表达有重要关系，但目前尚无相关性的统计数据来定义此亚型。一些儿童早前B细胞白血病预后特殊好，除上述病例中超二倍体肿瘤以外，那些伴(12;21)(p21;q22)的病例预后也较好C这些易位产生了融合基因TE1./AM1.1,并主要见于种早前B细胞白血病,并且好发于I-IO岁的儿童。流式免疫分型发觉,这些病例特异地强表达CD19.CD10和H1.A-DR.并会出现双峰表达CD34,部分细胞表达或失去CD9,部分细胞弱表达CD20;,CD66c(KORSA-3544)一样地不表达。CD1.O高表达伴CD9和CD20弱表达与TE1./AM1.1融合基因的产生有紧密关系。B45咱大PB-precursor-A1.1.的肿瘤细胞FS/SS信号弱，CD45表达也不强,有些病例的肿癌细胞在CD45/SSC图中与有核红细胞位置相当。B-precursor-A1.1.对应于FAB分型的1.1.和1.2型。Co1.Z0(OO1.KW*出6石JB-precursor-A1.1.的肿瘤细胞CD10/CD19强阳性，CD33弱阳性如使用PE标记的CD33抗体检测阳性增加但不行据此判定为混合型白血病C通常依据CD1.O表达与否可将B-precursor-A1.1.分为两亚型：CDI0+和CDIO-,CD1.O+的病人预后较好302RTCKAPPAF1CB-precursor-A1.1.与B-ce1.1.-A1.1.的区分在于肿瘤细胞表面是否表达免疫球蛋白轻链。PRE-B-A1.1.胞浆重链阳性而表面免疫球蛋白轻链阴性。犹如CD19,H1.A-DR在B-A1.1.中也广泛表达，但它没有特异性。其他有用的指标有CD22和CD20.前者几乎与CD19有相同的特异性而后者弱。CD24在很多B-A1.1.中表达，但它在一些AM1.也表达。在B-A1.1.中常见表达但没有系别特异的抗原有CD1.O和CD340CD34阳性在B-PreCUrSOr-A1.1.中常见,而在Pre-B或B-A1.1.则通常为阴性。前B细胞性A1.1.被定义为胞浆内U重链阳性，细胞处于B细胞成熟的后期阶段。前B细胞A1.1.也许占儿童A1.1.的25%,在成人A1.1.中的比例很低。与这一亚型相关的是tCM9）并产生E2A/PBX1融合基因，并因此而发生耐药.预后较差。前B细胞白血病也许有254的病例有t（1.：19）异位.但在原B细胞白血病中少见。A1.1.伴t（1.19）强表达CD19,CDIO和CD9并CD34阴性，而CD20常常缺失或弱表达，这样就形成了一个很特异的免疫表型。也许6O表现以上表型的病例经分子生物学检查发觉E2A/PBX1融合产物。而在其他免疫表型中未见此基因重排。流式细胞分析可成为分子生物学分析的重要初筛工具。成熟B细胞性白血病占全部A1.1.的2虬5务并包含Burkitt's淋巴瘤性白血病。在形态学上其对应FAB的1.3型，具有比无趣的B系原始细胞高的光散射信号。它们同时具有较强的CD45表达，从而这些细胞在CD45vsRA1.S双参数图中位置接近于更成熟的淋巴细胞和单核细胞。成熟B白血病细胞其胞浆膜上强表达IgC并表现为一样的CD19.CD20,CD22和CD24高表达,但CD34和TdT为阴性。很多病例CD1.O可阳性，但因其同时表达成熟抗原和S1.g可用来把成熟B细胞A1.1.与其他不成熟B细胞A1.1.区分开来。