3764-2020正式出版稿《医疗污水病毒检测样品制备通用技术规范》.docx

ICS13.060.30Z10DB32江苏省地方标准DB32/T37642020医疗污水病毒检测样品制备通用技术规范Genera1.techncak2020-03-12实施2020-03-11发布江苏省市场监督管理局发布I，-A刖三本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.为指导江苏省隆疗机构开展医疗污水中病毒的监测,规范医疗污水病毒检测样品制备流程，确保监测数据准确，根据医疗机构水污染物排放标准污水监测技术规范等有关规定，特制定本标准，本标准由南京大学提出.本标准由江苏省生态环境厅归口.本标准起草单位：南京大学宜兴环保研究院.南京大学.清华苏州环境创新研究院.本标准±要起草人：任m强、张徐祥.耿金菊、刘眼黄霞.文瞰宇、许机朱燕.周，J虹、刘艳臣、吴兵、黄辉.医疗污水病毒检测样品制备通用技术规范本标准规定了医疗污水病毒检测择W制备的试剂和材料、仪器和设符、样品采集、保存'运输和交接.样品制备、质量控制.废物处置和风险防范要求.本标准适用于医疗污水病毒检测择品制笛.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件.GB184662005医疗机构水污染物排放标准U91.12019污水监测技术规范U4212008医疗废物专用包装袋、容器和警示标志标准医疗废物集中处Is技术规范（SW亍）环发（2003）206号3术语、定义和缩BSiS1.1.1 和定义下列术语和定义适用于本文件.3.1.1医疗污水medicafeewater从事疾病诊断、治疗活动的医院.卫生院、疗养院.门诊部、诊所.卫生急救站等产生的废水，主要指医疗机枸门诊.病房、手术室、各类检验室、病理解剖室、放射室、洗衣房、太平间等处排出的诊疗康水'生活及费便污水.当医疔机构其他污水与上述污水混合排出时，视为医疗污水.1.1.2病毒virus由核酸和蛋白质外壳构成的严格他胞内寄生的非细胞生物.1.1.3样品制备samp1.epreparation根据检测方法的要求，将样品处理到符合后续分析要求的所有样品制餐过程，包括但不限于PH调节、预过渔和样品富集等步骤.1.1.4病密富集ira1.enricme11t通过吸附,洗脱.速心田悬浮.过池等技术方法，缩小样品体积同时提高样品中病毒浓度的过程.1.1.5空白样品将交物用水代苗实际样品,按照与实际样品一致的分析步曝进行测定.3.1.6空白加标样品b1.anks伙格实验用水代替实际样品,并添加巳知量标准物质，按照与实际样品一致的分析步强进行测定.3.1.7基体加标择Si在待测样品中添加已知量标准物质的样品,按照与实际样品一致的分析步探进行测定.3.1.8噬防体效价bactriophagetitef每38升试样中含有侵染性Ii菌体的粒子数，一般以鹿菌斑形成单位(P1.aqUeformingunitPF)计数.3.2缩珞语下列缩略语适用于本文件.4试剂和材料4 .1所用试剂应使用分析级试剂和无的死水，特殊慵况除外.42浓加酸溶液：t0)=3,i4.5 消毒剂：有效弱浓度为1OOomg/1.4.6 次就酸钠溶液I：有效就质量分数为5%.4.7 次氟酸钠溶液11:有效氯质量分数为0.1%.取20m1.次氯藻钠溶液I(4.6),与980m1.无由纯水泯合.4.8 硫代疣酸明溶液：噬S=5%,称取预先在1C5°CUOQ燥2h的硫代硫酸彷50g洛于950m1.纯水中，在20eCt2'C下平衡，混匀.放入聚乙烧咫或硬质坡璃瓶中,空封保存.J4.9 盐酸溶液：Q=1.ro1.量取83mk盐馥溶液(4.2)幽慢加入917ni水中，混匀。4.10 氯化镁溶液:烟眄=25moV1.称取预先在1cC1.1.t干燥2h的无水氯化镁23B0.溶解于80m1.A中，五求襁至100m1.混匀.4.11 幅微触I14H2SO4)=100mmo1./1.使用坡璃棒沿杯壁向纯水中堤慢加入5.4m1.浓硫激溶液(4.3),充分混匀,待冷却至室温后，加水福峰至1OOOm1.,放入聚乙肝瓶或硬质顼瑞密中，密封保存.4.12 稀蜕酸溶液II:设SOj=05mmo1./1.向螂中加入5m1.的稀磔酸溶液IR1.分混匀.待冷却至至温后，加水稀糅至1OOOm1.1放入聚乙烯瓶或硬质破谑瓶中，密封保存.4.13 氧箔化衲溶液I：C(NaOH)=1mo1.1.称取4g氢氧化的溶解于纯水中，混匀，待冷却至室温后，加水稀释至100m1.放入聚乙烯瓶中，密封保存.4.14 氢氧化钠溶液11:婀M=1nroH)向侬中加入1m1.氢氧化钠溶液IAB充分混匀，加水桶降至1000m1.,并放入黑乙燃瓶中，密封保存.4.15 100×Tris-EDTA缓冲液祢取1211q三超甲基源基甲烷/336q乙二胺四乙酸二钠溶解于80m1.究水中，使用盐酸溶液(4.9)调节PH(B型8.0,加水稀降至100m1.板入噬乞烯版中，密封保存.4.16 藻酸盐谯冲液：郡取磷酸二国抛0.58g,璘酸W二的2.5g,融化钠8.59溶解于850m1.袋水中，定容至1OOOm1.,转移至硬质顼璃期中于121°C灭凶15min,于4'C保存，不超过1个月.4IZ玻埼纤维谑膜:直径90m帆径045m04.17 混合纤维素酷源膜：表面负电涉糜,直径90mm,孔径0.4Sm.4.19 超混离心管:容积ISnt配有100Ms膜。4.20 图心修：材质为聚丙虎,容枳ISm1.4.21 凉存管：容枳2m1.5仪器和设备5 .1水质取样鬻：容积不小于2500m1.材质为有机破璃.5.2 H空泵：13高压力大于或等于400kPa,最高出空度大于或等于-80kPa,品高空载流量大于或等于201.min5.3 砂芯过谑器：谑头直径为90mm,接收瓶体积为1Ooom1.并配笛淞斗.5.4 高速冷冻离心机：离心温度可在4C2OCC急固内调节，转速可在0p10000g范围内调节，KSSOm1.规格离心管.5.5 超低温冰箱：最低保存温度为80aC.5.6 冰箱：温控应囹能够保证达到28aC.5.7 PH计：测量范围014,屐小分度为0.1PH单位.6样品采桀、保存、运谕和!交接6.1样品采集61.1应按照H1.911-2019中51和GBB1.66-2005中6U频定设置单位污水徘放口,并设置排放口标志.6.1.2采样前应了解医疗污水来源及性质、排放规律、医疗污水处理工艺、污水类型和污水琲放标准等慵况.6.1.3 在单位污水排放口设就监测点位，应按照GB18466-25中6.1.2的规定.当监测污水处理设施对病毒的整体处理效率时,应在污水进入污水处理设施的进水口和污水处理设施的出水口设置监测点位；当监测各污水处理单元对病毒的处理效率时，在各污水进入污水处理单元的进水口和污水处理中元的出水口设置监测点位.6.1.4 单位污水排放口的监消点位，监测频率每月不应少于1'次；污水处理设施的进水口和污水处理设施的出水口的监测点位，监测频率每季度不应少于1次；污水处理单元的进水口和污水处理单元的出水口的监测点位，监测频率每季度不应该少于1次.6.1 .5采样濒率为每4h采样1次，一日至少采样3次，测定结果以日均值计.6. J.6收治了传染病病人的医疗机构，应根据GB1846S-2005中6.1.3的规定增加采样解.单位污水琲放口的监测点位，应每日监测；污水处理设施的进水口和污水处理设施的出水口的监测点位，抵周不应少于1'次；污水处理单元的进水口和污水处理单元的出水口的监测点位，每周不应少于1次.7. 1.7采样容器采用聚乙蟠组料桶，使用前应用次»1酸钠溶液II(4.7)浸泡30min,并使用无蒐水冲洗3次.8. 1.8采择前，水段取样器应用次氨酸钠溶液11(4.7)浸泡30min,并使用无笳水冲洗3次.9. 1.9采样前，水质取样器和采样容器应使用待采样品冲洗3次.6.1.10样品采集体积应不少于51.保存于聚乙端型用桶中.6.1.11若样品为经过有效氯消毒的污水，应在采样后立即用疣代硫酸衲溶液(4.8)充分中和游离余源.可考虑每升水样添加10m1.琉代疣酸讷溶液(48),混匀.6. 1.12样品容器上应粘贴标识或标签,采集时记录样品信息，注明编号、采样日期.采样地点和采样者姓名等信息.6.2样品保存、运输和交接6.2.1 样品保存、运输和交接应符合HJ91.1-2019中第7章的规定.6.2.2 采样后，样品应立即冷感避光保存,冷藏温度宜为26C-86C.样品采集结束后应密封保存，并使用75%乙心原拭消毒或有效制1000mg/1.的消冷剂对外包装擦拭消毒后，再进行二次密封后装运回实览空.6.2.3 运输过程中应防止样品容器而冻、破裂.温度升高或外部污染.6.2.4 样品的制备应在24h内完成若因实验条件限制而去及时完成，应将水样于-20保存,不超过1周，目应避免反复冻融.7样品制的7.1总则7. 1.1医疗污水病毒检测样品包括吸附于污水中悬浮颗粒物表面的病毒检测样W和污水中游S8态病毒检测样品.8. 1.2样品制餐应尽量于采样现场完成.若现场不满足制备要求，应按照6.2的规定转移至实验室进行处理.9. 1.3根据病毒楼31的具体要求，样品制备可选择但不隈于下列过程,包括样品的PH调节、预过这和病或富集等步骤.10. 技术要求7.2. 1用于分样和装样的器具均应灭菌处理.7.2.2 离心管.冻存管等耗材均应采用市倍经环氧乙烷灭葩产品.7.2.3 过港装置中市高湿器材宜使用压力蒸汽灭葩；不耐高温器材宜使用次源酸钠溶液11(4.7)浸泡30min,并使用无恙水冲洗3次.73P节根据水样PH值，使用盐隙溶液(4.9)或氢氧化钠溶液I(4.13)将水样PH值调节至7.07.S.7.4预过波与悬浮颗粒物病毒检测样品制备7.4.1 姐装玻璃纤维/胺过i®装B1.74.2取7.3得到的21.水样进行预过滤，以去除水样中悬浮颗粒物，过港后这液转移至21.玻璃烧杯中.若水样中悬浮J5粒物含量较高,出现池腰堵塞,过也流速缓慢的情形，应适时更换沈城.7.4,3格7.4,2得到的含有悬浮颗粒物病毒检2!择品的液璃纤维这腰放入无的庖心笆中，于-80-C保存，应于6个月内完成后续实蛤分析.1.5 游离态禽布检测样品制备1.5.1 1向7.4.2得到的谑液中加入20m1.氧化镁溶液(4.10),充分搅拌均W1.5.2 组装混合纤维素明池腴过池装置.1.5.3 7.5.1得到的水样进行过泣,以吸附水样中的游离态病毒，奔去i®液.1.5.4 向漏斗中加入200m1.硫酸溶液II(4.12)对涌联进行冲洗，弃去冲洗液.1.5.5 使用IOm1.运玩化钠溶液11(4.14)对谑85表面的游幽态病田颖应进行洗脱，洗脱液收集于15m1.无解离心管中.756向洗脱液中加入50疣酸溶液IfU1001.100xTris-EDTAg中液(4.15)中和氢氧化辆溶液,得到游尚态病毒冷母液.1.1.5.7 7.5.6得到的游罔态病毒浓缩液转移至超渡留心管中，可根据超渡离心性使用说明，选择合造圄心力和鹿心时间，得到体积约为600P1.游鹿态病毒浓缩液样品，弃去下层渔液.1.5.8 将7.5.7得到的游离态病用浓缩液样品转移至凉存管中，于-80CC保存，应于6个月内完成后续实验分析.1.6 数据记录将采样时间、地点、工艺类型'采样位点.浓缩前体积.浓缩液体枳.空白加标回收率.基体加标回收率、保存方式等参数记录于医疗污水中病毒样品采集和制备记录表中，记录表样式参照表A.I.8质量控制8. 1实蚣过程应按照附录B规定的方法，选择噬SB体MS2作为标准物陵,使用双层平板法测定样品制法前后逆笛体MS2的效价.并计14样品制待过程中雇凶体MS2的回收率.8.1 实版过程应严格设置空白样品.空白加标样品和基体加标样品.8.2 每批样品应设置一个空臼样品实验.空白样W实验中病毒不得检出.8.3 每批样品应设置一个空白加标样品实版.空白加标样品买版回收率应不低于50%.8.4 每批样品中设置基体加标样品数量不低于总样品的10%,若样品数量不足IO个，应至少设胃一个基体加标样品实验.基体加标样品实验回收率应不低于10%.9废物处遇9. 1样品采集和实验过程中产生的所有固体、液体废弃物的处JS应按照医疗废物集中处R技术规的的规定进行.9.2医疗废物专用包装袋.容器和警示标志应符合HJ421-2008中第7章规定.10风睑鲂范10.1 现场采集10.1.1 采样过程采样人员在样品采集全过程，应限戴医用外科口罩、一次性椎胶手套、一次住工作皑和一次性监套.疫情期间采样应限戴符合N95/KN95及以上标准的医用防护口草,还应加穿双层一次性乳胶手套、一次性防沪股、全面型If吸防沪器或正压式头套(若条件有限，可蚓啦封闭式护目篮等)；口;5胜污、变形、损坏、有异味或连续见JE4h应及时更涣.10.1.2 采辐束采样结束后，防护要求如下：一应喷洒7S%乙酚对仪器设笛进行臻挝消毒,仪器设筋在返回单位入库前应再次用75%乙酣进5行二次消毒；一采样人员应立即用有消毒功能的洗手液或肥皂和流水洗手，返回住所后应及时全面清洁；一采样人员应使用含塞消硒、75%乙所或消毒湿巾对个人防护用品进行消毒；一疫情期间采样人员应采用生物安全三级防护要求顺序脱防护服并立即使用含消毒功能的洗手液或肥皂和流水洗手，同时使用含氯消毒液、75%乙外或消田湿巾对个人防护用品进行消毒.10.2 样品运输10.2.1 运送人员在运送过程中应穿戴鲂护手套、医用防护口第、工作服、靴等防护用品.10.2.2 感染性样品在运送过程中发生意外情况导致样品溢出、散落等情况时，应立即向本单位应急事故小组取得联系，并在受污染地设立隔离标识，其他车箱和行人不得穿过.10.3 实验室分析10.3. 1实览室应符合二级生物安全防护要求.10.3.2 实蚣室工作人员应合理安排仪使用和实轮进行的时间，避免空内人员过于空集.多人同时进行实验（条件允许情况下，可打开排风设缶保持空内空气清新）.10.3.3 实验前对实验室工具、仪器、实验台表面进行餐外消毒30min,实给后先用够乙酌或含酌消毒湿巾等消毒工具藤咸白毒，再进行紫外消毒30mio处理、检测疫情期样品时应在有负压的二级生物安全实验室中进行实蛉.10.3.4 实舱室工作人员进行样品交接时，应假戴医用外科口跳、一次性像股手套.一次住工作帽；疮情期间接取样品时，交接双方宜保持1.5m以上，并斛戴一次性掇胶手套，符合N95/KN95及以上标准的医用防护口罩，还应使用75%乙酚对样痣外包装进行消毒处理.10.3.5 实验室工作人员处理.测试样品时应全程做戴一次性工作幅、全面型呼吸防护舞或正压式头套（若条件有限,可佩戴封闭性护目镰八医用防护口罩.防护I1.（1.一次性乳JS手套.一次性畦套.10.3.6 实蛤空工作人员进行样品检测时，应及时更换被样品污染的手套.10.3.7 实验工作人员应使用单独的清洗池清洁，避免与其他非实验人员共用清洗池.附录A（资料性附录）医疗污水病毒检涎样品采集和制笛记录表A. 1表A.1给出了医疗污水病毒检测样品采集和制备记录表格式.表A.1医疗污水病毒检测样品采集和制号记录表第页共页Hff1.:tt:医疗机施名琢:医院污水处理站联糜人、联系方式：工艺芟31:棒员第号：果样位点：浓缩前体限米缗液体积:空白加标回收率器体加标回收率：像存方式：柒择人：样品制各人：记录入：校对人：备注:附录B(娩的性附录)医疗污水病毒枪溯样品制备过程中质量控制方法B1.试剂和材料B. 1.1所用试剂应使用分析纯试剂和无菌纯水.B.1.2磷酸建蛋冲液：警考4.16.B13逆菌体M2贮存液：AT(115597-B1.效价不低于IOeiPfWm1.的噬菌体M2贮存液。根据本附录B.4方法测定其实际效价.B.1.4噬菌体MS2工作液：根据座茵体MS2贮存液实际效价，使用无菌或酸盐缓冲液稀样三10PRJm1.B15宿场茁E.cd.ATCC15597,遂由休MS2宿主如函做CogT02和0.4之间。B.1.6固体培养基平板制筋:固体培养基A组分经121P灭笛15min后，隆温至45X-SOvC加入50m1.ig美星B组分，充分混匀后，逐个倾倒入直径为150mm的平板.凝固后置于4P保存，不超过1周.注1：固体培养丛A姐分：分取胰生日济iog.1.化钠8g,i*同提取用1g,球能1$g,加入950mim；培养基8担分：称取管的情10a1.1.化钙294g.维生素B100mg,加入500水.完全溶解后,采用孔径为0.22JJm的计式过龙H过JS除药.除Ri后于4保存.不超过1W.B.1.7半固体培养基制备:半固体培养基A组分经121灭南15min后，置于4工保存，不超过1周.注2:半固体培养基Ata分：称取陵蛋臼炼10g,泰化的8g.航母提取物1g,iS!65g,i入950mg水.B1B一次性针式过池器:m径251111孔径022r11s8.2 仪器和设备8.2.1 生化培养箱：培养温度可在0C60CC厄国内码节.8.2.2 恒温水浴偶：温度可在室温至99范围内两节.8.2.3 2.3电子万用炉：功率为10W.8.2.4 生物安全柜：安全等级口.B25压力蒸汽灭前器:灭菌温度可升至121尽力可维持O1.Mf¾)15M8.3 质量控制样品的设解8.3. 1实验中应设置空白样Sk空白加标样品和基体加标样品.8.3.2 每批样品应设置一个空白样品实验.采用2(无菌磷酸盐绫冲溶液作为空白样品.8.3.3 每枇样品应设置一个空白加标样品实版.采用2I无茁淡酸盐袋冲溶液添加1m1.场苗体MS2工作液(B.1.4)作为空白加标样品.8.3.4 每批样品中设置基体加标样品数量不低于总样品的10%,若样肋数量不足10个，应至少设置一个星体加标样品实验.采用2I医疗污水样品添加1m1.嗟笛体MS2工作液(B.1.4)作为基体加标样品.8B.4遂菌体MS2效价的测定8.4. 1采用双层平板法测定噬菌体MS2效价.B.4.2培养基准备要求如下：a）使用电炉加热半固体培养基A组分至电化，降混至45tC50°C,与培养基B组分按醺950：50的比例混合得到半固体培养J1.将混合后的半固体培养基按需分装至无三B圈心管中，每管中加入35m1.半固体培养范.分装后半固体培养基放入45P水浴锅中保持温度，防止凝固.b）取固体培养基平板,将样品名杯、实验时间和实验人标记于平板背面，倒置于37P生化培养箱预热30mh,C）待祝祥品量的谢哥.待测的应迸行梯度稀释，按照1:10,1:100和1:1OOO进行稀稀,用于后续测试.d）向分装有半固体培养基的离心管中加入拂度焉释后待测样品量5m1.,宿壬的菌£.C。2.5m1.,鹿心脸上下熊倒溜匀，避免产生气泡.e）将混有样品和宿主的西E.c"衲半固体培养基分别加入到5个已预热的固体平板中，每个平板中加入8.5m1.待半固体凝固后，倒置放入生化培养箱，37'C培养16h24h.f）在培养基平板上选择清麻的噬菌斑进行计数.应选择怪函斑个数介于30300的平板进行计数，若怪菌斑个数超过300,则应对样品进行进一步稀标亚新开展实验.每个样品对应5个平板的唯的迸个数分别记为Rt1.,明里解和PIt5。8.5. 果表示与计算8.5.2 施菌体MS2效价的计算每个样品对应5个平板的噬菌斑个数分别记为P1.t1.,P1.t2,P1.t3,P1.t4和PItS,则该样品中噬菌体MS2的效价可按公式（BI）计算：Ph1÷P2+P3+Pn1.+P1.tS,1,1nU,IUI-I83.8”YB.I.式中：I一噬菌体效价，PFU/m1.；V一样品体枳,单位为安升（m1.）.B.5.2回收率计算医疗污水中病毒桧测样品制各过程的回收率可按公式（B.2）计算：Rzy×100（B2）V*B式中：R回收率，%；1 样品落幅后遂菌体MS2的效价，PFU/m1.；V1.一样品制备后的体积，单位为毫升（m1.）;I样品制备前嗟菌体MS2的效价，PFU/m1.；H一样品制备前的体枳,单位为东升（m1.）.参考文就HJ493水质采样样品的保存和管理技术规定HJ2029医院污水处理工程技术规危D832/T3547医疗机构废水处理及在战监测技术指南医院污水处理技术指南环发2003197号新型冠状病田显炎5露冈睑防范手册一环保相关从业人员叫）,北京：中国环境出板社，2020新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案（试行）坏办水体函（2020）52号新冠病毒疫情环境风险防控与应急管理技术手册（第一版）,国家长江生态环境保沪修算联合帕detectionofs的戈媪部HaiwodMicrobio1.2015,81(6)：2042-2049