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尿素法提取小麦DNA的评价杜盈雪中央民族大学北京市海淀区100081摘要：目的本实脸以小麦幼叶为实脸材料，进行小麦基因组DNA的提取。通过实脸掌握根本的实脸技能。方法本实脸通过尿素法进行小麦基因组DNA的提取，并且通过实险原理及实脸现象进行方法的改进。结果尿素法可以提取小麦基因组DNA。结论尿素法可以提取小麦基因组DNA,并且提取的DNA能够满足后续测定。关键词：小麦幼叶、基因组DNA、尿素法、OD值，琼脂糖凝胶电泳Eva1.uationofwheatDNAextractionbyureamethodDuyingxueMinzuUniversityofChinaHaidianDistrict,Beijing1.OOOS1.Abstract：ObjectiveInthisexperiment,Weusewheat1.eavesasexperimenta1.materia1.s,toextractthegenomicDNAofwheat.Throughtheexperimentweshou1.dmasterthebasicski1.1.s.MethodsTheexperimentuseureamethodtoextractthegenomeDNAofwheatandimprovetheexperimentthroughtheexperimentprincip1.eandexperimentphenomeno.Resu1.tsUreamethodcanextractthegenomicDNAofWheat.Conc1.usionsUreamethodcanextractthewheatgenomeDNAextraction,andtheDNAtomeetthesubsequentdetermination.Keywords：Young1.eavesofWheat,ThegenomicDNA,Ureamethod,OD,Agarosege1.e1.ectrophoresis前言【研究背景】DNA是遗传信息的载体和根本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA,因此从植物中提取高质量的DNA非常重要【研究目的】小麦是全球30%人口的主要粮食来源，是世界第三大粮食作物。随着全球人口2050年预计到达90亿，有预测称普通小麦须增产70%才能满足未来需求。而小麦增产最重要的方法之一就是转基因，转基因的前提就是了解小麦的基因组，因此提取小麦DNA是非常重要的。【解决方法】查阅文献可知，尿素法从未提取过小麦基因组DNA,但曾有人用尿素法提取过小麦相近的植物水稻和玉米，于是猜想尿素法也可以提取小麦DNA。1.材料和方法1.1.实验仪器常温离心机（上海安亭科学仪器厂制造、TG1.-16G）、恒温水箱（金坛市鸿科仪器厂、HH-420）、微波炉（合肥荣事达三洋电器股份、EM-308E81）、高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器、HC-2518R）1.2 实验试剂尿素裂解液成分：7mo1.尿素,0.3mo1/1.氯化钠,0.034mo1.1.十二烷基肌氨酸钠,50mmo1./1.Tris（pH8.0）,20mmo1.1.EDTA（pH8.0）,B-流基乙醇（ME）约2%（参加量可根据所用材料而定，如叶片细胞中次生物质含量高，可适当加量）。氯化钠和-筑基乙醇为国产试剂，其它均为Sigma公司产品。TriS-饱和酚、氯仿和异戊醇混合液，体积比为25：24：10TE缓冲液成分（pH8.0）：10mmo1./1.Tris-HC1.,1mmo1./1.EDTA。1.3 实验方法1.3.1 DNA提取的试验方法在离心管中参加约20u1.-ME（B-苑基乙醇）和2m1.裂解缓冲液，并彻底混合均匀.称取约0.5g小麦叶片，放入预冷的研钵中用液氮迅速研磨，研磨充分后转入裂解液中混匀.参加2m1.Tris-饱和酚、氯仿和异戊醇混合液（通风橱操作），充分混匀，约15min（混合动作要轻柔）以4400转/分（冷冻离心机）转速离心20min,取上清约2m1.,参加0.3m1.10mo1.NH1AC混合均匀（裂解、离心充分的上清透明不浑浊，如上清颜色呈褐色，应适当增加的B-ME量）。参加2倍体积经预冷的无水乙醇，轻柔转动离心管，直到形成絮状核酸沉淀，并在一20C保存20min4>以12000转/分（冷冻离心机）转速离心约15min,快速倒出乙醇再参加浓度为70%的乙醇，轻柔晃动管子数次洗涤，以去除残留的尿素和盐离子。参加20U1.的TE缓冲液溶解DNA。1.3.2 三次试验步骤的不同1、第二次试验设置了两组对照一组是用原来的研磨方法，另一种用的是直接在离心管中研磨，省去转移步骤；离心速度由4400改成了12000转/分；在混匀时的动作更为轻柔。2、第三次试验多设置了高盐组，研磨方法均为直接在离心管中研磨，省略去转移步骤。2.屡次使用酚氯仿异戊醇的混合液来处理；洗涤时也洗涤了三次；在实验中参加了RNA前来处理。1.3.2基因组DNA质检测利用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析检测基因组DNA的质量和浓度。2.结果与分析2.1 第一、二、三次实验结果图ABCDEFGHI图1第一二三次实验结果BEF为maker,A为第一次尿素法结果，CD为第二次尿素法结果，G1.为第三次尿素法结果，H为高盐尿素法所得Figure1theresu1.tsofonetwothreeexperiments(BEFismaker,Aisthefirsttimeureatestresu1.ts,CDissecondtimesofureamethodresu1.ts,GIisthirdtimesofureamethodresu1.ts,Histhehighsa1.tandureamethodincome)2.2两种抗生素在100、50、25、12.5、6.25(gm1.)下抑菌圈大小的效果表表1第一二三次试验OD值Tab1.e1theonetwothreetestOD组别OD值ACDGHIOD2300.0130.2000.1310.2030.1960.224OD2600.0020.3880.2540.3910.2440.460OD280-0.0020.2200.1310.2110.1160.252OD260/OD280-11.7631.9381.8532.1011.825OD230/OD2606.50.5150.5160.5190.8030.4863 .讨论由第一次实验结果和第二次试验结果相比，第二次试验结果在OD值上有很大的进步，而且第一次试验结果主带不清晰，拖尾长并且清晰，第二次、第三次试验结果不仅在提取量上有很大进步，主带清晰，拖尾明显改善，蛋白质的去除也比拟干净第三次试验结果中，将尿素裂解液中的盐浓度变为3.5mo1.1.,发现效果并不好，由于只作了一组实验，实验结果可能存在偶然性，于是判断提高盐的浓度对于此实验影响并不大，由于后面的实验步骤中，有高盐溶液，可以判断结果并不可信，分析得，主要是由于在配置高浓度Nac1.尿素裂解液时，盐并未充分溶解，盐固体使DNA物理降解，因此造成如下图结果。可以看出在后面两次实验结果OD值都在合理范围内，OD280/OD260在1.8左右，而OD230/OD260在0.5左右，并且提取的DNA条带主带清晰，可以说明提取的DNA的纯度可以满足后续反响。我们发现改变了些实验操作可以使结果更好：(1)采用预冷的无水乙醇沉淀核酸，因为在冰冷的乙醇中，基因组DNA的沉降速率比其他杂质快【；(2)在形成絮状核酸沉淀后立即倒出无水乙醇，防止杂质与核酸发生共沉淀造成污染，使核酸处于蓬松状态，利于溶解；(3)适当增加离心时间和转速，采用水平离心的方式，确保杂质能够彻底沉淀山】。4 .结论尿素法具有操作简单、快速、高效、产率高等优点，制备的基因组DNA质量高，可以用来提取小麦DNAo致谢：衷心感谢刘利亚老师为我们提供充分的理论课根底，感谢刘利亚老师不辞辛苦为我们指导实验，为我们准备各种所需物品，感谢学院为我们提供条件良好的实验设施，让我们顺利完成实验，培养我们动手能力及科研精神！参考文献(ReferenCeS)1郑卓，李健，圣忠华，彭智勇，罗宝.高粱总DNA不同提取方法的比拟J安徽农业科学,2007,36:11758/1759.2张平,夏东升,蔡亚君,曾庆福,王军.多种方法提取芝麻组织基因组DNA的质量比拟J.湖北农业科学,2014,11:2682-2685.3伍艳芳,江香梅,肖复明,熊振宇,邱凤英.高质量丝栗楮基因组DNA的提取方法J林业科技开发,2012,05:82-85.4石庆华,姚正培,张桦,许磊,代培红.4种提取鹰嘴豆基因组DNA方法的比拟J.新疆农业大学学报,2009,01:64-67.5徐虹,郑敏,章军,朱斌琳,张娇挺,袁文杰.三种樟科植物的细胞总DNA提取J云南植物研究,2004,04:451-457.6韩玉杰,贾炜珑,王自霞,周小梅.几种提取植物DNA方法的比拟J.山西农业科学,2008,07:1719.刘欣,祝长青,王毅谦,沈赞,黄明,蒋原,周光宏.大豆转基因检测中DNA提取方法的比拟研究J食品科学,2013,04:199203.8曹文波,郑璐璐,谢文海.一种提取植物基因组DNA的方法改进尿素法J华中师范大学学报(自然科学版),2008,03:448451.9代翠红,李杰,朱延明,纪巍,柏锡不同DNA提取方法对4种重要作物DNA提取效率的比拟J.东北农业大学学报,2005,03:329-332.10 ZhuHX,YuanT.Asimp1.emethodforextractingtota1.DNAofPaeoniaSuffruticosaandPaeoniaIactif1.oriaJ.ShandongForestryScienceandtechno1.ogy,2005,4:53-54.11 ChenHY,SunZD,MaoYJ,eta1.StudiesonextractiongenomeDNAinCymbidiumgeoringiiRchbfJ.Mo1.ecu1.arP1.antBreeding,2006,4(1):135-142.Themodificationureamethod:animprovedmethodforp1.antDNAiso1.ationCAOWenbo1,ZHENG1.uIu1.,XIEWenhai2