乌药活性成分去甲异波尔定对大鼠佐剂关节炎的抑制作用.docx

乌药活性成分去甲异波尔定对大鼠佐剂关节炎的抑制作用乌药活性成分去甲异波尔定对大鼠佐剂关节炎的抑制作用#魏志风，戟岳*(中国药科高校中药药理教研室，南京210009)摘要：目的建立大鼠佐剂关节炎(adjuvant-inducedarthritis,AIA)模型，探讨乌药主要活性成分去甲异波尔定(norisObo1.dine,NOR)的治疗作用，为将其研制成治疗类风湿性关节炎的药物供应药效学依据。方法在大鼠左后足跖和尾根部，分别皮内注射弗氏完全佐剂诱发A1.A,造模14天后，将大鼠随机分组，给药组分别灌胃赐予NOR和地塞米松(dexamethasone,DEX),连续10天。探讨NOR对大鼠原发性和继发性足肿胀、体重及关节炎指数的影响。造模后第24天，取大鼠膝关节，制作组织病理学切片，HE染色，视察NOR对大鼠关节炎症及骨损伤的爱护作用：自大鼠腹主动脉取血，制备血清，趣联免疫法(E1.1.SA)检测NOR对循环中前炎因子TNF-和I1.-I水平的影响。结果模型组和DEX组大鼠的体重明显减轻，NOR(15,30mgkg)能够有效阻挡AIA大鼠的体重减轻现象：NOR(30mgkg)和DEX(0.5mgkg)明显减轻AIA大鼠关节的肿胀和红斑，降低关节炎指数，减辂软骨和骨的损伤程度，并能显著降低血清中TNF-和I1.-I水平。结论NOR可有效改善I大鼠的关节炎症状，减轻骨损伤程度，其机制可能与抑制前炎因子的产生有关，该化合物可望成为治疗RA的中药新药。关键词：去甲异波尔定：佐剂关节炎：前炎因子：骨损伤中图分类号：R285Norisobo1.dine,themainactiveconstituentofRadix1.indcrae,inhibitsadjuvant-inducedarthritisinrats510152025303540WEIZhifeng,DA1.Yue(DepartmentofPharmaco1.ogyofChineseMatcriaMedica,ChinaPharmaceutica1.University,Nanjing210009)Abstract:ObjectiveTheeffectsofnorisobo1.dine(NOR),iso1.atedfromRadix1.inderae,onadjuvant-inducedarthritisinratswereinvestigatedtoexp1.orethetherapeuticpotentia1.onrheumatoidarthritis(R).MethodsIwasinducedbyasing1.eintraderma1.injectionofFreundscomp1.eteadjuvantintothe1.efthindpawsandthebaseofthetai1.ofrats.Ratswereora1.1.yadministeredwithNORandDcxamethasone(DEX)fromday14forconsecutivetendays.EffectsofNORontheswe1.1.ingofbothinocu1.atedandnon-inocu1.atedpaws,themeanbodyweightsandarticu1.arindexscoreswereobserved.Moreover,b1.oodwasco1.1.ectedfromratsonday24aftertheyweresacrifiedwithether.Thejointtissueswereremoved,ands1.icedforHEstaining.Resu1.tsNORtreatmente1.evatedthebodyweightsofIAratsincontrasttoDEXtreatmentwhichresu1.tedinafurtherbodyweight1.ossofrats.NOR(30mgkg)WaSshowntonotab1.yreducetheswe1.1.ingofbothinocu1.atedandnon-inocu1.atedpaws,articu1.arindexscores.Histo1.ogica1.examinationofnon-inocu1.atedpawsrevea1.edthatNORnoton1.ya1.1.eviatedsynovia1.inf1.ammationbutobvious1.yreducedthedestructionofjointboneandcarti1.ageinI,rats.NORa1.sosignificant1.ydecreasedtheserum1.eve1.sofTNF-andI1.-1.ThesefindingssuggestedthatNORwasab1.etorepresssynovia1.inf1.ammationinarthritisrats,andprotectjointboneandcarti1.agefromdestructionbydown-regu1.atingtheproductionofProinf1.ammatorycytokines.NORisprobab1yacandidatedrugforRAmangement.Keywords:Norisobo1.t1.ine:Adjuvant-inducedarthritis;Proinf1.ammatorycytokine;Bonedestruction基金项E1.：高等学校博士学科点专项科研基金(No.20090096110007)作者简介：魏志凤(1985-),女,博士探讨生，中药抗炎免疫药理学通信联系人:戴岳(1963-),男，教授，中药抗炎免疫药理学E-mai1.:yuedaicpu0hotmai1.-1-0引言类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种慢性的全身性炎症疾病，其发生可能45与环境、病毒、遗传、性激素及神经精神状态等因素相关1仍不清晰，但主要的病理学变更已经明确，即关节滑膜边缘细胞增殖，大量的浆细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润到滑膜组织，形成血管翳，产生前炎因子等，最终造成了软骨及骨组织50的破坏。RA除了导致关节受损外，关节旁边的肌腱、腱鞘、滑囊也可受侵，同时皮肤、呼吸、血液、神经、肾脏、心脏、眼等多种器官或系统亦可受累2,3在RA病理过程中有多种炎症因子、趋化因子的共同参加,如inter1.eukin(I1.)-I,I1.-1,I1.-2,I1.-3,I1.4,I1.6,I1.-8,I1.-15,I1.-17,interferon(IFN)-,tumornecrosisfactor(TNF)-,transforminggrowthfactor(TGF)-等。其中，TNF-和I1.-I是两个重要的参加者，它们55能够引起其它前炎因子的产生：激活滑膜成纤维细胞表达粘附分子，诱导白细胞趋化到受损关节；增加滑膜巨噬细胞和成纤维细胞合成基质金属蛋白酶的速率；抑制软骨蛋白聚糖的合成等。同时，它们还可以通过干脆加强核因子-B受体活化因子配体(receptoractivatorofnuc1.earfactor-B1.igand,RANK1.)的信号转导，激活破骨细胞，恶化关节损伤程度4,5临床探讨已经证明，抗TNF-单抗和I1.-I受体拮抗剂均可改善RA患者的滑膜炎症和骨损伤6,760乌药为樟科植物乌药(1.inderaaggregate(Sims)Kosterm.(1.Strychnifo1.iaVi1.1.)的干燥块根，药用历史悠久。中医认为乌药辛温香窜，可上入脾肺，下通肾经，是理气散寒止痛的常用中药。乌药含有异哇咻类生物碱、缩合糅质、挥发油和倍半砧内酯等多种成分，乌药总碱能够显著抑制A1.A大鼠的继发性足肿胀，降低其体重减轻，而对原发性足跖肿胀仅65呈抑制趋势，其机制可能为下调机体T淋巴细胞和H噬细胞的功能8的生物碱成分，前期探讨表明，NOR能够减轻胶原关节炎小鼠的异样免疫反应，并且能够通过阻挡丝裂原活化的蛋白激函(MAPKs)磷酸化，下调脂多糖引起的小鼠巨噬细胞中I1.-KTNF-.一氧化氮等前炎因子的表达，发挥抗炎作用9,10大鼠炎症反应和关节骨损伤的爱护作用，为其进一步探讨开发打下基础。1试验材料药品和试剂701.INOR为灰白色粉末，纯度98%,由上海中医药高校中药探讨所翕桂新教授供应：液体石蜡，江苏洪声化工厂；地塞米松(DEX),浙江仙堀制药股份有限公司；粉甲基纤维素钠(CMC-Na),广东汕头市西化工厂：酪酸菌干粉，BD公司；大鼠TNF-和I1.-IE1.ISA75检测试剂盒，RD公司。NOR和DEX以0.5%CMC-Na混悬。试验仪器1.2超低温冰箱，ThermoE1.ectron公司:BSIIOS光学读数分析天平，北京塞多利斯天平有限公司：大鼠足趾容积测量仪，H制；倒置显微镜，重庆光学仪器厂：离心机，Kubota公司。80o尽管其具体的病理生理机制。NOR是乌药中主要。本文探讨M)R对AIA-2-1.3试验动物雄性SPragUe-DaW1.ey(SD)大鼠，180220g,由上海斯莱克试验动物有限公司供应，饲养于232C的环境中，自由摄食和饮水。2试验方法2.1大鼠AIA模型的制备85液体石蜡，高压灭菌20min,冷却后将其与充分研磨的卡介苗按KmD：10(mg)的比例配成弗氏完全佐剂(FCA),于大鼠左后足趾及尾根部皮内注射FC501致炎，致炎当天记为d0o另取8只大鼠，用同样方法于其左后足趾皮内注射等量的生理盐水2.2动物分组和给药11,1290造模后C114,依据继发性肿胀程度将大鼠随机分组，分别为模型组、地塞米松(0.5mgkg)组、NOR低剂量(7.5mgkg)组、NOR中剂量(15mgkg)组和NOR高剂量(30mgkg)组。在C114至d23期间，每天灌胃给药(Im1.Z1.OOg)1次，正常组及模型组大鼠赐予等容量的0.5%CMC-Na,连续10d。2.3关节炎指数95致炎后d1.1.d1.7、d20、d23,依据非致炎足的肿胀状况以及耳后红斑、尾部结节的发生状况，对全身关节病变程度进行评分，计算关节炎指数(arthritisindex,A1.)o非致炎足肿胀状况评分：0分：无红肿，1分：个别足趾轻度红肿，2分：趾关节和足趾中度红肿，3分：踝关节以下足爪明显肿胀，4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀且不能负重：耳后红斑及尾部结节的评分：0分：无耳后红斑和尾部结节，1分：仅出现耳后红斑或尾部只出现100个别结节，2分：耳后出现红斑且尾部有个别结节，3分：耳后出现红斑且尾部有明显结节，4分：耳后红斑明显且尾部结节严峻。将各个关节的积分累计相加，即为每只大鼠的I13原发性足肿胀测定2.4于致炎当日及致炎后d1.、d4、d7、¢110.(112、¢114.d1.7>d20.d23,分别在足容积测定仪上测定大鼠左后侧(致炎侧)足容积，致炎前后足容积的差值记为大鼠原发性足肿胀度。2.5继发性足肿胀测定105于致炎前及致炎后d1.4、d1.7、d20、d23,分别在足容积测定仪上测定非致炎侧足容积，致炎前后足容积的差位即为继发性足肿胀度。大鼠体重测量2.6大鼠于致炎当口及致炎后d1.、d4、d7、diO、d1.2、d1.4、d1.7、d20、d23,分别称市，110视察大鼠体重变更状况。大鼠关节病理组织学检查2.7致炎后d24,乙处麻醉处死大鼠，取各组大鼠的非致炎侧踝关节，固定后石蜡包埋，切片，苏木素伊红染色(Henatoxy1.in-Eosinstain,HE),光学显微镜视察病理组织学变更。2.8大鼠血清中TNF-和I1.-I水平的检测115致炎后d24,腹主动脉取血，300OrPm离心20min,取血清，E1.IS试剂盒检测血清中。-3-TNF-和I1.-I水平。数据统计分析2.9全部数据均以MCanSS.E.M.表示，Dunnetfs法检验比较组间差异。3试验结果3.1对A1.A大鼠AI的影响120如图1所示，h大鼠I显著高于正常组，赐予NOR(15,30mgkg)可显著降低大鼠的A1.阳性药DEX(0.5mgkg)亦显著降低A1.Fig.1Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)onarticu1.arindexscoresofadjuvant-inducedarthritisrats.Fromday14aftertheintraderma1.injectionofFreundscomp1.eteadjuvant,ratswereora1.1.yadministeredwithNOR(7.5,15,30mgkg),DEX(0.5mgkg)andvehic1.eforconsecutivetendays,respective1.y.Articu1.arindexscoreswereassignedtoeachratpawonindicateddays.MeansS.E.M.,11=8.*P0.05,*P0.01vs.mode1.;0.01vs.norma1.1251303.2对AIA大鼠原发性肿胀的影响如图2所示，大鼠注射弗氏完全佐剂后数小时即发生持续肿胀，d4达到第一高峰，随后起先消肿，10d后再次持续肿胀。NOR(30mgkg)及DEX(0.5mgkg)灌胃给药10天，显著抑制AIA大鼠原发性肿胀。-4-135Fig.2Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)ontheswe1.1.ingofinocu1.atedpawsofadjuvant-inducedarthritisrats.Vo1.umesoftheinocu1.atedpawswc1.1.ingweremeasuredusingap1.ethysmometeronindicateddays.MeansS.E.M.,n=8.*P0.05,*P0.01vs.mode1.;3.3对A1.A大鼠继发性肿胀的影响附P0.01vs.norma1.佐剂注射后d1.4始，大鼠出现明显的继发性足肿胀,N0R(30mgkg)和DEX(0.5mgkg)140145对此呈现显著的抑制作用（图3）。Fig. 3 Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)ontheswc1.1ingofnon-inocu1.atedpawsofadjuvant-inducedarthritisrats.Vo1.umesofthenon-inocu1.atedpawsswe1.1.ingweremeasuredusinganorma1.PO.O1.vs.p1.ethysmometeronindicateddays.MeansS.E.M.,n=8.*PO.05,*P0.O1.vs.mode1.;-5-3.4对I大鼠体重的影响如图4所示，继发病变出现后，AIA大鼠较正常大鼠体重显著减轻，NOR(15,30mgkg)150155组大鼠的平均体重高于模型组大鼠，而阳性药地塞米松(0.5mgkg)加剧模型大鼠的体重降低。Fig. 4 Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)onbodyweightsofadjuvant-inducedarthritisrats.Bodyweightsofratsweredeterminedonindicateddays.MeansS.E.M.,n=8.*P0.05,*P0.01vs.即3.5对AIA大鼠踝关节病理变更的影响相比正常大鼠的关节组织，T模型大鼠的关节滑膜细胞有明显变性，且有大量炎细胞浸涧，关节软骨和骨有不同程度的破坏。NOR(30mgkg)和地塞米松(0.5mgkg)使大鼠关节组织的炎症明显减轻，骨和软骨的损伤得到明显改善(图5)oP0.01vs.norma1.,mode1.;-6-160165Fig.5Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)onthehisto1.ogica1.changesofjointsinadjuvant-inducedarthritisrats.Onday24aftertheintraderma1.injectionofadjuvant,thekneejointsofratswereremoved.Thentheywerefixed,sectionedands1.icedforHEstaining.Pathohisto1.ogica1.gradeswereeva1.uatedaccordingtoinfiItrationofinf1.ammatoryce1.Is,synovia1.hyperp1.asia,pannusformation,catiIageandboneerosion.Thehisto1.ogica1.scoresofa1.1groupsweresummarized.MeansS.E.M.,n=8.*PO.05,*P0.01vs.mode1.：即对I大鼠血清中TNF-和I1.-I水平的影响3.6A1.A模型大鼠血清中TNF-和I1.T的水平均显著高于正常组，而NOR(30mgkg)及DEX(0.5mgkg)能够显著降低血清中TNF-、I1.-I的水平(图6)O170P0.O1.vs.norma1.,(origina1.magnification200).-7-Fig.6Effectsofnorisobo1.dine(NOR)anddexamethasone(DEX)ontheserum1.eve1.sofI1.-IandTNF-inadjuvant-inducedarthritis(I)rats.B1.oodofAIratswasco1.1.ectedonday24afterratswereSacrificiedwithether.TheI1.-IandTNF-Ieve1.sintheserumweremeasuredusingE1.ISAkits.MeansS.E.V.,n=8.*P175#4结论RA是一种慢性的致残性疾病，慢性炎症导致软组织肿胀、软骨和骨损伤，严峻影响患者的生活质量。我国RA患病率为0.32限Q34%,现有患者约400万人，是造成人群劳动力丢失和致残的主要病因之一14180大鼠AIA是一种常用的RA动物模型，其组织学特点和人类RA相像15用于RA相关领域的探讨中，其发朝气制可以分子模拟理论说明，即结核杆菌的一个蛋白分子与关节滑膜上的一个糖蛋白分子结构相像，两者被同一株T细胞克隆所识别，从而诱发产生针对关节的免疫反应16本文探讨结果显示，NOR对I大鼠的关节炎症状具有明显的改善作用，显著抑制大185鼠原发性、继发性足肿胀,对抗大鼠的体重减轻。NOR(30mgkg)显著降低关节组织中的炎细胞侵涧，改善软骨和骨侵蚀，并能够下调血清中前炎因子TNF-和I1.T的水平。综上所述，NOR口服给药对大鼠佐剂关节炎有明显的治疗作用，其抗RA机制可能与降低血清中前炎因子的产生有关，有望成为抗RA的中药新药，其具体作用机制有待进一步探讨。190参考文献(References)1李颍，汪悦，覃仕化,谢凌寒.类风湿性关节炎的探讨.进展.中国矫形外科杂志，2011;19(7):581-584.P0.01vs.norma1.0.05,*P0.01vs.mode1;0OAIA被广泛。-8-2涂胜豪，陈哲.雷公藤治疗类风湿关节炎的现状和存在的问题.中西医结合探讨，2009:1(1)：42-44.3种涛，巴哈尔古丽力体甫，张继东，于峥，赵宏艳.类风湿性关节炎的中西医治疗进展.中国中医基础医学杂志，2010;16(2):176-177.4Finze1.S,RechJ,SchmidtS, 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