基于mRNA-LNP技术的(细胞)免疫治疗产品开发指南.docx

CCSB38CS65.020.20团体标准T/FDSAXXXXX-XXXX基于mRNA-1.NP技术的（细胞）免疫治疗产品开发指南GuidelinesforthedevelopmentofCellimmunotherapyproductsbasedonmRNA-1.NPtechnology（征求意见稿）XXXX-XX-XX实施XXXX-XX-XX发布中国食品药品企业质量安全促进会发布目次前吉III引吉IV1范围12规范性引用文件13术语和定义24缩略语55mRNA-1.NP制备及质属控制65.1 模板质粒序列设计与合成65.2 模板质粒序列设计与合成质fit控制75.3 建立种子批系统75.4 种子库检定相植定性研究85.5 模板质粒制备85.6 模板质粒质限控制85.7 质粒DNA线性化Il5.8 线性化质粒DNA原液质优:控制115.9 nRNA合成125.10 mRNA合成质地控制145.11 mRNA纯化195.12 mRNA原液质J控制205.13 脂质纳米颗粒Mix配方与mRNA包封/装我及纯化245.14 纳米颗粒质肽控制265.15 mRNA-1.NP制剂处方以及工艺265.16 mRNA-1.NP成品质业控制286工程化免疫细胞制备及质量控制336.1 供者细胞的获取、收集与运输336.2 供者细胞收集质麻控制546.3 T/NK细胞分选与激活356.4 mRNA-1.NP转染T/NK细胞及CAR-TZNK细胞犷增356.5 CR-TNK细胤半成品或中间细胞产物的侦t控制366.6 CAR-TZNK细胞收获与成品分装366.7 CAR-TZNK细胞成品质量控制与放行367功能验证407.1 动物实验407.2 临床研究/临床试蕤468初科管理488.1 试剂和生物活性分子488.2 耗材和包装材料499生产环境与设备499.1 厂址选择和总平面布置499.2 工艺设计509.3 清净区域环境参数509.4 生产操作环境洁净度级别509.5 建筑设计509.6 设备管理5010人员51!0.1人员要求5110.2 人员安全防护培训5110.3 人员活动限制51附第A（资料性）RNaSC残留检测荧光探计测定法52发聚B（资料性）dsRNA残留检刈（EUSA法）54暴杀C（资料性）DNase残留检测荧光探针测定法57附录C（资料性）总蛋白含量（荧光法）检测59、第F（资料性）mRNA疫苗包封率检测61附显F（资料性）粒径、PD【及衣面电势（ZCIa电位）检测63时显G（资料性）活细胞密度和细胞活率测定法64，：泉H（资料性）PBMC表型分析测定法65时亲I（资料性支原体核酸犷墙测定法67参考文献68Il本文件按照GBrrI.I-2O2O£标准化工作导则第I部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件中的某"内容UJ能涉及专利.本文件的发布机构不承接识别专利的责任.本文件Ih中国食品药品企业防技安全促进会提出并归1.I.本文件起草单位：本文件主要起笊人：Ill基于mRNA-1.NP技术的（细胞）免疫治疗产品开发指南1范围本文件适用于基于mRNA-1.NP技术的（细胞）免搜治疗产品开发的全流程和相关质疑管理，包括mRNA1.NP制茶及质奴控制、工程化免疫细胞制备及质价控制、功能验证，以及物料管理、生产环境、生产设备、人员管理等须迸结的蔚本要求和原则，后在帮助研究机构更好地利用mRNA-1.NP技术开发细胞免段治疗产品.本文件适用于科研机构、生产企业基于mRNA-1.NP技术开发CAR-T或CAR-NK细胞等免疫治疗产品的全过程。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成对本文件必不可少的条款。其中，注11期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件.GB,'T29022粒度分析动态光放射法GB.T42398细胞培养沽净空设计技术班范GB50457医药工业洁净厂房设计标准JGJ91科研建筑设计标准ISO17867粒度分析-小角度X射线散射IPaniClCsizeanalysisSmallangleX-rayScaiiertiig（SAXS）中华人民共和国药典（简称中国药典）国家药包材标准免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则试行）细胞治疗产品研究与评价技术指原则（试行）细胞制品研究与评价技术指&原则体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则试行基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）体细胞临床研究工作指引（试行药物非临床研究质俄管理规范脂质体药物非临床药代动力学研究指导俅则新药用辅料非临床安全性评价指导区则药物剌微性、过跛性和溶血性研究技术指导原则药品包装材料与药物相容性试脸指存原则医疗卫生机构开展研究者发起的临床研咒管理办法药物临床试验质量管理规范中华人民共和国人类遗传资源管理条例化学药品与邦性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研咒技术指导原则（试行化学药品注射剂与药用破烟包袋容器相容性研究技术指导原则（试行）化学药品注射剂生产所用的装科组件系统相容性研究技术指前（试行国际人用药品注册技术协调会（ICH）E6（GdClinicalPractice）来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价(ViralSafetyEvaluationofBimcclinologyProductsDerivedfromCellIjncsofHumanorAnimalOrigin)美国药典<TheUnitedStalesPharmacopoeia)3术语和定义1.1 1信使核器核酸(nRNA)MessengerRNA111RNAlDNA的一条鞋作为模板转录而来的中.集核精核酸.携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类埴集核岐核酸,在细胞内mRNA通过与核摄体结合，并在tRNA(转运RNA>的描助下，翻译成影肽流，进而形成蛋白质。mRNA在范因表达过程中起着承上启下的作用.它从DNA传递遗传信息，指导蛋白质的合成，从而控制生物体的生长,发行和功能。1.2自扩增核糠核酸(saRN>Self-amplifyingRN自犷地RNA是一种能携以自身序列为模板,进行自我扩增的线性mRNAsaRNA主要衍生于甲病毒基因组,通过性换病毒结构蛋白的编码基因序列编码来构建.因此saRNA保持了源于RNA病毒段体的白夏初活性，在进入细胞内后可以像病毒一样,能膨利用宿主细咆进行自我制制，并指示细胞持续制造治疗性蛋白侦来发挥作用。1.3环状RNACcircRNA)circularRNA类电道闭合的RNA分子，由mRN前体通过可变剪接产生，与传统的雄性RNA不同.CircRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切帧影响,表达更稳定,不易降解.1.4体外转录Invitrotranscription主要是以质粒DNA为模板通过体外转录科到RNA,常用的是以线性化质粒DNA或KR扩增产物为模板利用RNA聚介院在体外转录合成.1.5PlE(PcmiutcdIntron-Exon)系统一种将inRNA合成环状RNA的系统.通过序列设计将天然的内含子、外显子反向剪切而形成新的内含子外显子构建体，可以在构建体中间插入目的序列，这个构建体为PIE系统。1.6超谑ultrafiltration一项联分离技术，主要以压力为动力，将大分子与小分子进行分离，常用于溶液中溶剂的置换,样品的纯化等.1.7RNAR触RNaseR具有佛化功能的小分子RNA.属于生物推化剂.RNascR能消化线性RNA(1.inearRNA).但不能消化环状RNA(CircularRNA.circRNA).套索RNA(1.ariatRNA).3'突出末地少于7个核甘酸的双能RNA以及具有熨杂二级结构的tRNA、5SRNA等.1.8脂质纳米颗粒(1.NP)lipidnanopa11iclc是一种由多个腑炭成分构建的纳米级坡体.它通常由可电离腑质、辅助脂质、胆囿醇和PEG化脂质组成。1.9坡合物分散性指数(PDI)POIydiRCNityindex种描述颗粒尺寸分布均匀程度的参数,PDI的侑越小，煤粒尺寸分布趟均匀；反之，PDl的值越大，颗粒尺寸分布趋不均匀.3. 10佐剂adjuvant与抗原同时或预先注射，Ur非特异性地增强或改变机体对抗原免疫应答的物刷,称为佐剂.4. 11微流控micro11uidic使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升).5. 12氮谈比(NJP)nitrogenPhO冲horusratio基于阳肉f胺缸(在阳禹干脂质中)和核酸中瞬酸基团浓度计算正负电荷之比.6. 13跨稹压(TMP)Iransmenibranepressure纯化系统中跨越透析膜两侧的压力差.7. 14免疫原性immunogenicity能引起免凌应答的性能,即抗原能刺激特定的免校细胞.使免疫细胞活化、增殖、分化.最终产生免疫效应物鲂抗体和致敬淋巴细胞的特性.3.15转录Transcription是遗传佰息从DNA流向RNA的过程.即以双族DNA中的确定的条林(模板链用于转录，编码链不用于转录)为模板，以A、U、CG四种核糖核甘酸为原科，在RNA案合酹催化卜合成RNA的过程。8. 16质粒plasmid类存在于细曲和口曲细胞中独立于染色体DNA而自主发制的共价、闭合、环状DNA分子,通常携带一定数盘的基因.是基因工程最常见的钱体.外周血单个核细胞(PBMC)Pcriphenilbloodmononuclearcell血液中具有常个核的细胞,主要包括淋巴细胞、单核细胞、巨细胞、树突状细胞和少量其他细胞类型.3.18核器核酸的(RNasc)ribonuclease水解核糖核酸(RNA)中磷酸二而犍，生成我核甘酸或用核fF酸的核酸倏，3.19脱氧核维核酸的(DNasc)deoxyribonuclease水解脱氧核糖核酸(DNA)中璜酸二酯键，生成密核件酸或单核件酸的核酸的.3.20STR分析shorttandemrepeatSTR分型检测是一种用于检测人类及嘀乳动物的基因组，3.21T细胞T-IymphocytcT淋巴细胞来源于骨骼的多功能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝.在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一都分多能干细府或前T细胞迂移到胸取内，在胸腺激素的透V下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞，3.22感受态细胞conpee11cell理化方法诱导细胞，吸收冏困环境中的DNA分子,使其处于必地摄取和容纳外来DNA的生理状态.3.23核昔酸nUcleutide核苻酸是一类中噪吟碱或嗤啾“、核械或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物,又称核戒酸.3.24自然杀伤细胞(NK)naturalkillercell自然杀伤细胞是机体中要的免授细胞，不仅与抗肿痛、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别杷细蛆、杀伤介质。3.25原液Bulk指用于制造最终配制物(Filialfomwlation)或半成品(FinalBulk)的均物质。3'UTR：3r非翻洋区(3,Un(ranslatedregion)5*UTR:5,非翻译IX(5*Un-translaledregion)ArP：腺嚎吟核件.软酸(adcncsinetnphosphatc)CAR：嵌合抗原受体(ChimcricAntigcnRcccpior)CAR-T：嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcell)CR-NK:嵌合抗原受体NK细胞(chimericantigennccep<orNKcell)CAR-qPCR：测定CAR部分的qPCR方法(CARQuantitativePCR>CD3÷:分化抗原赧3(ClusicrofDifrcrcnliaiionS)CD4+：分化抗爆旗4(ClusterofDiffeniiaiion4)CDS+：分化抗原睽8(ClusterofDiferenlialion8)CRS：细胞因子择放综合征(cytokinereleasesyndrome)DIT：剂破限制性毒性DoseIimilingIcxicity)DN/：脱笈核脑核酸(DeoxyriboNudeicAcid)ddPCR：微滴式数字PCR<DmplclDigitalPCR)dsRNA：双链核糖核酸<double-strandedRNA)E1.ISA：脚联免疫吸附试验(cn/yme-linkcdimmunosort>cn(assay)FACS：流式细胞术(HowCytometry>FOB：功能观察i粉组合(FufKliunalObserviHionBallery)GTP：鸟甘；：磷酸(Guanosinetriphosphate)HHV：人类抱母病毒(Humanherpesvirus)HP1.C：高效液相色谱法(HighPerformance1.iquidChromatography)HP1.C-CAD：高效的高效液相色谱电雾式检测器(high.perl>11三celiquidChromatOgraPhydiodcarraydetection)H1.A：人类白细胞抗原(humanIcukOCylCanligCn)HT：研究者发起的临床试胎(Investigator-InitialedClinicalTrial)I1.-2：白细跑介素2(interleukin2)I1.-4：白蒯胞介素4(interleukin4)I1.-6：白细胞介素6(interleukin6)11.-I0：臼细胞介素IO(interleukin10)INF-y：干扰素7(InIerfenongamma)1VT：体外转录(Invitrotranscription)1ST：药企发起的临沐试验<Induscrj-SponMHcdClinicalTrial)mRN:信使RNA(MeSSagerRNA)mRNAseq：转录组测序技术(InRNAMXiUaKing)nickedRNA：CircRNA的开环异构体NAT：核酸犷增检测法(nucleicacidamplificationccst>NTP：核件三磷酸(Nucleoside(riphos>hate)PBMC:外冏血单个核细胞(Peripheralbkx)dHwnonuclearcell)PCR：聚合fi锥式反应(PolymcrascChainReaction)Poly（八）：聚的味吟(PoIyiUicniiYc)RT-PCR：逆转录PCR(ReverseTranscriixionPCR)pruRNA：前体RNA(precursorRNA)1.1.1 2.6免疫毒性已有的临床研究结果和CAR-TXNK治疗的原理显示CAR-TZNK细胞产品必然具有免授毒性，目前研究结果也显示免按毒性，如CRS等，与细胞治疗的效果显杏相关.然而，因非临床研究中尚无可以直接预测人CAR-T/NK细胞的临床免疫毒性风险的理想的动物模型.需要对不同动物模型中获得的免疫毒性检测结果进行客观的分析以评价其预测能力.CAR-TNK细胞在非峪床免疫诉性检测包括但不限于以下指标：a）来用流式细胞方法、MSD电化学发光检测等方法检测血清细胞因子水平（如I1.-2、I1.-4、I1.4I1.-10,INF-y、TNF-CI等）.以期待反映CAR-TZNK细胞的CRS风脸b）根据使用动物模型的不同.检测动物外周IhI中淋巴细胞计数及表型分析（如CDV.CD4CD8'等：C）并种细胤移掖物抗宿主反应（GvHR的观察和与临床研究可能相关性的科学评价：d）免疫潺官检查（揖加、大体和组织病理检查）.7.1.9 .2.7神经毒性7.1.10 1.9.2.7.1方案设计可在适当模型上进行神经毒性考察.常规的安全茹理学功能观察试脸组合（FOB）研究i殳计（给药次数，给药周期，检测领事）等不一定适合CAR-T/NK细胞的作用特点,根据采用动物种属或模型的不同，可以设计妥次给药或者延长观察期以考察神经毒性，此外，应尽Ur能与其它由性研究相结合,重点观察神经珞性.7.1.11 2.7.2关注要点CR-T.'NK细胞治疗产生的神经毒性可能与CRS具干j相关性，认为是CRS损伤血脑屏障,血管内皮受损，细胞因子进入脑内导致的。因此，可以考虑在临床研究中出现CRS的时间点进行一次FoB的观察.另外,对干在不能很好模拟CRS的动物模型中进行的神经毒性考察的意义有待审慎考虑.7.1.12 致福性研究作为一种终末分化的体细胞治疗产品,理论上CAR-TZNK细胞成脩性，致瘤性风险较低.体外评价方法软琼腑克隆试胎可通常点现为阴性结果.在基因组插入位点分析中，因插入是随机的，每例患者的插入位点可能不尽相同；即使插入位点为可Ife致施的位点，随着CART/NK细胞死亡或体内对CAR-TZNK细胞的免疫应答，也无法确定其致痛性.但对于导入了外源基因的CAR-TZNK细胞产品.需通过病毒载体辅入人基因组的插入位点分析、体外细胞永生化增殖、体内研究中异常/异位增生性病变（如增生、肿陶等研究初步评估其致痛性风险。体内致瓶性研究可与较长周期的动物毒理学研究伴崩开展，可以在临床武验期间完成。7.1.13 特殊安全性基于mRNA-1.NP技术的（细胞）兔疫治疗产品通常为部脑给药途径,福进行局部耐受性（血管刺激和肌肉刺激）、体外溶血试验，具体可参照约黝刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则.7.1.14 脂质体毒性对于国内外制剂产品中尚未使用过的全新脂质体，宜遵循匕新约用铺料非临床安全性评价指导原则对其作用安全性及其功能效应进行详细的研究.此外宜重点关注生殖毒性和制剂、DNA侪等“8.1.4 对于怕了类似物、核甘酸等原材料的质量标准应含有可充分表征产品相关杂质的纯度检测，如质谱、核段、HP1.C等方法。8.1.5 原液和制剂生产过程中原则上应避免人或动物来源的成分。如果使用人源或动物源物质,应符合中国药典相关规定和/或参照来改于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性坪价等技术指由提供外游因子风险评怙.8.2耗材和包装材料8.2.1成品制剂宜按!氟化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行方£化学药品注射剂与药用玻信包奘容涔相容性研究技术指导原则（试行）化学药M与弹性体密料件相容性研究技术指导原则（试行等相关技术指导原则开展包材相容性研究并注意资料保存，可作为注册申报的相关资料.根据加速试脸和长期试脸研究结果确定所采用的包装材料和容器的合理性宜在稳定性考察过程中增加样品倒置等考察，以全面研咒内容物与股塞等密封组件的相容性.8.2.2原液、制剂生产工艺中使用的所有与产品接触的耗材（如储存袋、硅胶管、微流控芯片、管道等）.雷保用相关研究资料或其他适用的支持资料，保剂支持包材相容性的研究数据.8.2.3直接接触原液或制剂的包奘材料和容器应符合国家药监局颁布的包材标准.根据制剂的特性和临床使用情况选持能保证药品质疑的包装材料和容器,9生产环境与设备9.1厂址选择和总平面布置9.1.1厂房选择厂址选择在综合考虑地理因素、自然因素以及非臼然因素的比较方案后确定.宜符合以下要求：a）需时厂址所处的自然环境进行考察，确保厂区及周边自然环境的大气条件良好、土地无污染、水源状况良好、无虫害和鼠害：宜考虑远离鑫菌源和花粉传播源,以减少花粉时产品污染与交叉污柒.在厂区尽显避免种擅花卉：b）厂址应远SS铁路、码头、机场、交通要道以及散发大量粉尘和有古气体的工厂、贮仓、堆场等严重空气污染的区域，避开水质污染、振动或噪声干扰的区域：C）厂址应选择在水、电.气供给充足,切换便利的区域,以确保生产动力来源有保障.此外，还应关注厂址现有公用线路或管线的迁移时厂房建策、药品生产J1.艺和产M质，的影响;d）厂址选择时应考察周困企业的“二度”（废气、废水、废渣）排放的种类与数量，避免“三废”对生产和产品质量的影晌.在选址与规划时,应确保“三废”处理的渠道和空间，满足国家对环境保护的要求.9.1.2总平面图布置9.1.2.1厂区的总平面布置除满足国家有关工业企业总平面图设计要求和环境保护要求外,还需考虑避免交叉污染.9.1.2.2厂区宜按生产、行政、生活、辅助等不同使用功能合理分区布局.9.1.2,3应合理组织人流、物流的走向，同时满足生产工艺流程的要求和消防安全要求”9.1.2.4三废处理、悒炉房等有较为产重污染的区域.应位干全年最小频率风向的上风（W.9.2 工艺设计厂房设计工艺布局宜参照GB50457M医药工业洁净厂房设计标准3、GBfr423984细施培养洁净空设计技术规范$等要求进行设计和布局9.3 洁净区域环境卷数洁净区域的隹设和参数设计，宜参照GBSO457i医药工业洁净厂房设计标准3、GB.T42398彳细胞培养洁净室设计技术规范等要求进行“9.4 生产掾作环境洁净度级别细胞产品、直.接用于细胞产品生产的基因修饰载体或其他起始生物材料，其生产操作环境的洁净度级别可参照表12中的示例进行选择.12生产掾作环境的洁净度级别沽净度级别细胞产品生产悚作示例B线背景下的A级1,处干未完全密同状悠下的生产操作和转移：2 .无法除曲过注的溶液，培养珞的配制，3 .找体除的过滤后的分装.C级背景下的局和A级1 .生产过狎中采用注射拓对处十密闭状态下的产丛和生产川溶液进行取样：2 .病毒囊体生产用细胞的传代探作;3 .可除丽过逑的溶液和培养基的配制;4 .枚怵的除侦过迪CI.采用非径闭系统（如使用透气位的细施增群战殍在培养箱中培恭：2.饯你的她化操作。D级I.乘用密闭港路转移产品、溶液或焙除基：2,采用小例霰统或设符巡行编腆产品、畿体的生产操作（如在隔船器中进行产用的无做分装）'取样I3.质粒生产用工程菌或病麻找体生产用细胞在密闭耀中的发保.注：衣格中除D拨以外的生产煤作示例均指在非解密系统下的操作.9.5 建筑设计厂房的建筑设计,包含消防、给排水、电气设计、静电防护等均宜参照GB50457医药工业沽净厂房设计标准3相关要求进行设计和建造，通风系统和空气调节系统宜参照JGJ91科研瓢筑设计标准的相关要求进行设计及建造.9.6 设备管理设备的设计、选型、安装、改造和维护应符合预定用途，尽可能降低产生污染、交叉污染.混淆和差错的风险,便于操作、清洁、维护,以及必要时进行的消毒或灭菌.宜建立完善设备管理程序或操作规程，对设备使用、清洁、潍妒和维修、检定或校准进行管理，并保存相关操作记录.A.3.2荧光酶标仪参数设置A.3.2.1自动增益参数设置：终点模式，检测演振板1075s,激发波长入E=535nm,发射波长卜Em=575nm,增益透项设置为自动增益。A.3.2.2自动增益检测:在96孔板上选择2孔，每孔加入IOu1.RNA探针工作溶液和IOU1.IOx反应液：其中1孔加入SoU1.无DNasc无RNasc水,另外1孔加入SoU1.标准品I；37匕避光放词30min后测武，将数值设词为样本测试的增益值，以避免灵侬吱下降或信号过饱和的风险.A.3.2.3样本测试参数设置：温度37T：检泅前振板1015s,激发波长AEX=535nm.发射波长Em=575nm,增减值设定为A.3.2.2中得到的自动增益值：每1.5min测试一次，总时间31.5min,若和标仪支持动力学检测.可采用动力学检测模式.A.3.3荧光定量PCR仪参数设函设置为相对定量,HEX或VIC通道：反应程序37P恒谓,每l.5min读取荧光，21个循环。A.3.4上样检测A.3.4.I按表A.2进行标准品和样本加样,每种样本2个复孔.注意I邈免在孔壁上部进行加样，加样时注意不可激出，不可产生气泡，如果产生气泡,可以用移液涔吹打或用较细的吸头戳破气泡.表A.2样本配制表组分体枳（1.）标准占6、7.8、9/恃测样本SORNA探针工作溶液1010×>ftIO但体枳100A.3.4.2荧光脩标仪或荧光定量PCR仪检神：将阴性对照（无DNaSe无RNase水、标准品及待测样本在同一块板上测试.得到起始荧光值RFUOmin和终点荧光值RFU3（）mn.A.3.4.3定性判断：若RFU30min（待测样本）2×RFU0min（待测样本,则考虑待测样本被RNaSC污染，注：若恃测样本严爪污染或含方干扰构崂时，可能幺出现RFUomin（特测样本）RFUOmin（标准品3，I1.RFU30而111卷测样本V2醺n10111加（律测样本,牙效假叨性剂断.此时应将侍测择本川无DNaK无RNaSC水进行预稀年.再进行依测.A.3.4.4定盘判断：计算ARFU=RFSOmirbRFUOmin,以ARFU（无DNaSe无RNase水）、ARFU（标准品）为双坐标，标准品RNaseA浓度为横坐标（无DNaSe无RNase水浓度为0）.进行线性拟合.求出拟合方程y=ax+b,相关性系数r要NO.99,RFU（待测样本）作为y帚入方程,求出X,乘以样本预稀择的数后，为特测样本的RNaSC残留活性.注:四仪备丁；波动.刚性对照和无污染样本可能会出现ARHJ0的情况.此时判断为无污染.即RNase残留活性为0.8.3.2.1.1 标准品工作溶液：取用l1.的dsRNA标准品(所用修饰类4!应,jmRNA样本匹配，用STEbUffCr将其稀择成浓度为100Pg“的标准品工作溶液,待用.8.3.2.1.2 精诙吸取标准品工作溶液(100P如U，先稀科至标曲最高浓度，再按照Bl梯度进行林择。a) 无修饰、PUTP修饰dsRNA标准品用STEbuffcr稀择至1、0.5、0.25、().125、0.0625、0.0312、0.0156pg1.,配制方法见表B.I.b) NI-Mep1.ITP修饰dsRNA标准品用STEbuffer稀择至2、1、0.5>0,25>0.125,0.0625X0.0312pgJ1.配制方法见表BZc) 5-0Me-UTP修饰dsRNA标准品用STEbUffer稀择至4、2,1、0.5,0.25.0.125,0.0625pg,l.配制方法见&B.3.d) STEbUfTer为空白对照。表B.lUTP、PUTP标准曲线把制编号接浓度_Cp)1.>STEbuffer工作标准品100491.11.5ng,1.标准品A149M1.51.l(Klpg1.溶液B0.52501.2S01.A溶液C0252S01.2501.B溶液D0.1252S01.2501.C溶淞E0.06252S01.2S01.D溶液F0.03122S<>1.2501.E溶液G0.01562S<)1.2S4)1.F溶液H02S01./表B.2Nl-Mc-pUTP标准曲线配制编号终浓度M伐方法(P刖1.)STEbuffer工作标准品1004昨1.l1.SngU1.标品A249<>1.01.100PgH1.溶液B12S01.2501.A溶液C0.52M)1.2501.B溶液D0252S4>1.2S01.C溶液E0.1252S<)1.2501.D溶液F().06252S01.ZSOp1.EJgJSG0.03122S01.2“m1.F溶液H02S4)1./表B.35-C)Mc-UP标准曲线配制i4燧浓度拓仔方法(Pw1.)STEbuffcr工作标准品l491.l1.5ng1.标晶A44S01.2(1.100Pgjl1.溶液B22S<>1.2501.A溶液C12S01.2S01.B溶液D0.52501.2S01.C溶液EQS2S01.2S01.D溶液F0.12525OH1.250H1.E溶液附录C（奥料性）DNase残留检测荧光探针测定法C.1试剂或耗材除另有规定外,试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水为灭菌双蒸水或实验室11级纯水.C.l.lDN抵e依测试剂盒（灵光探针法）.C.I.2荧光探针工作液：将DNA探针40007000rpm离心60秒，使之聚集至管底，小心开启管费,加入401.TE援冲液溶解为探针储存液,根据单次使用量进行分装后于-20C储存.避免反复疥融.每次使用时取出探针储存液.稀择50倍作为DNA探针J1.作溶液，未使用完的DNA探针工作溶液干20C储存，避光储存，避免反我冻WkC.1.3移液器吸头：无DNaSe无RNaM5.C.1.4EP管：无DNaSC无RNasC.C.2仪器设备C.2.I荧光解标仪（含exm=485S25nm波长，具有熠益假调节功能），配食无DNaSe无RNasc黑色不透明底96孔防标板使川.C.2.2荧光定属PCR仪（含FAM通道）：配套无DNasC无RNasc的qPCR八联管或qPCR96孔板使用，C.2.3离心机.C.3试验步骡0.1标准品工作溶液精密吸取DNaSCl标准品（2U1.）,用标准品稀择液和无DNaSC无RNasC水按表Cl表稀择.表CJ标准品配制表标准品编号配制过程浓收I21.标送丛原液+l981.标准M林秣灌2x¾1.221.iI惊准+198g标准瞌林怀液2×IOU1.3100P1.编2怵准晶UOOJI1.怵准晶稀弊液XXOOH1.无DNly无RNjinc水×5,1.4100Og1.Siv3标准品To（W标/晶松杼液一%01.无DMe无RNase水5x04t)1.5100Oji1.编号4标准拈+100p1.标准处褪杼液MXXl1.无DNaw无RNasc水2.5xlO*U/p1.6IOaIH1.i5标准如lOO1.尿准丛林秣液+OoOV1.尤DNase尤RNasc水l.25xrV'1.C.3.2荧光酶标仪参敛参考C.3.2.I自动增益参数设置：终点模式,检测前振板1015s，激发波长XEx=485nm.发射波长NEm=525nm,增益透项设置为自动增益。C.3.2.2自动墙益检测：在96孔板上选择2孔，短孔加入IO1.DN探针工作溶液和IO1.IOX反应液：其中1孔加入X01.无DNasc无RNasc水,另外1孔加入801.标准品I：37C避光放置30min后测试特数值设置为样本测试的增益位.以避免以敏度下降或信号过饱和的风险。附录E奥科性)mRNA含量及包封率检测El试剂或耗材-IN倍J4IIaHEE.2OEE除另有规定外,试剂均为分析纯或生化试剂,实验FlI水为灭前双蒸水或实验室Il级纯水.Quan(-iTRibOGrCenIMRNAAssayKit试剂;°IXTE媛冲液制符：20×TE缓冲液用HyPUNTMM。ICCUlarBiHogyGradeWaicr稀译RihOGrCCni:作液制备：RiboGrecn原液刖IxTE缓冲液稀糅200倍，避光放置.10%质量比破乳剂：称取一定质状的TritOnTMXloo(molecularbiology),加入适Jit体枳的水，水浴加热使TriIUnIMXlOo充分溶解。E.1.5离心管：0.2m1.E.2仪器设备E.2.I荧光分光光度计.E.2.2版标仪.E.2.3微家移液器：10u1.、100u1.E.3试除步骡E.3.1样本准备E.3.I.1标注曲鼓配制E.3.I.1.I标准品工作溶液：取用21.的同批次mRNA标准品(同批次mRNA原液),用IXTE缓冲液料其稀择成浓度为2.()g'm1.的标准品工作溶液,待用.E.3.I.I.2精密吸取标准从工作溶液(2g,m1.),Ol.21.,41.81.,20l.401.于0.2ml.离心管中，各加入IXTE缓冲液至0.1m1.，再分别加入100lI1.RibOGreen工作液混匀后,孵育3min后,等待上机检测.E.3.I.2质量控制样品配制精密吸取标准品工作溶液(2gm1.>,61.,151.301.于0.2m1.离心管中,各加入IXTE缓冲液至0.1m1.,再分别加入1001.RiboGrecn工作液混匀后，解ff3min后，等恃上机检制.E.3.I.3样本配制E.3J.3.I游离的mRNA检测样品预处理；用适宜的稀择剂进行稀择，平行制需两份样品。E.3.1.3.2破乳样品预处理(总的mRNA)：根据样品理论浓度，取相同体枳的待测样品与质量比为10%的TritionX100破乳剂进行破乳,以移液怆吹打10次.样M应澄清.用适宜的稀徉剂对破乳后的样品进行稀择，使其稀柞后理论浓度为I.Ogm1.,平行制备两份样品,E.3.I.33将预处理的样品佛择，实际稀择体积可根据检粉等比例放大,具体处理过程见表E.l<.表El样品配制表杆&名称l×TE<1.>RiboGreen工作淞(1.)预处理样本(1.)幡择倍数游阳的mRNA50.0100.050.04破乳样本<总的mRNA>50.0100.050.04E.3.1.3.4将用制完成的样品混合均匀，并在室温下避光照行3min楞育完成后等侍上机检测。E.3.2样本测定仪器参数参考：a)检测方式：光度检测。b)激发/发射狭缝宽：IOnnVlOnm.c)tlHis500V.d)增益：2.e)激发波长：480nm