Proposal ProteomeLab LI溶液中蛋白质相互作用分析.docx

溶液中蛋白质相互作用分析系统常波中委而质相互作用分析系统一，*MB*'»J并且国际上很多高水平的期内往往要求供应分析超离表征蛋白特性的数据作为证据.分析系统主要应用于以下领域：1 .蛋白质及蛋白质相互作用：分析系统可用探讨溶液中蛋白质间作用及否及其亲和力，蛋白质豆合物不同组分的比例等：2 .蛋白质及小分子/核酸间的相互作用：分析系统可以帮助分析小分子及靶蛋白间的结合及蛋白质及核酸间的结合：3 .蛋白属本身或其复合物的空间结构：分析系统可测定蛋白质的摩擦系数比()，进而推断蛋白质本身或其复合物的空间结构：4 .蛋白质修饰对空间结构及相互作用的影响：通过测定蛋白侦分子的沉降系数及扩散系数，分析系统可用于分析蛋白度在经修饰后其空间结构有无变更;5 .不同条件下，蛋白质亚基比例的测定(:或AB)：分析系统可测定蛋白质的分子量进而拟合得到蛋白质亚基的比例。仅能供应分子比，而不能鉴定真正的亚MRWM蛋白质在不JrtH"'"J林"子量及平衡常数，分析系统可用于分析不同溶液条件下的蛋白质自聚集现象。只限于不同蛋白质的结合试验，不能用于分子内自我结合的探讨；7.多种分子间的共同作用：分析系统可用于分析多种分子间的相互作用，并能检测不同分子结合的比例；8 .蛋白质结晶条件的筛选：分析系统可检测不同的值、离子浓度、温度等条件卜.蛋白质的存在状态，从而确定有利于蛋白质结晶的溶液条件；9 .蛋白质药物的配方探讨:分析系统可用于测定不同药物配方中蛋白质药物的存在状态，从而应用于药物的配方探讨。溶液中蛋白质相互作用分析系统基本原理分析系统备有紫外/可见光检测系统和瑞利O干涉光学系统，既保证了在低浓度条件下工作的尼敏度和建立在样品最大光汲取基础上优化检测的选择性，乂能够测量由于样品浓度变更导致的折射率的变更。这不仅提高了检测精度，同时还可以对更多种类的样品进行更大浓度范围的检测。在高速旋转产生的强大的离心力作用下，分子量或构型不同的分子在溶液中的沉降系数不同。的限制系统会实时扫描分子的沉降过程，并依据扫描所取得的数据计算出分子的特性。分析超高的分析方法主要有沉降速率O和沉降平衡。两种。沉降速率是一项流体动力学技术.沉降速率试验中，样品被高速旋转,溶质分子向样品池底部移动，通过记录的数据来测定溶质分子运动的速率。运动速率用沉降系数表示，它取决于分子量、分子形态或构象。对于不同细分的样品，依据不同的沉降系数检测每个组分。沉降平衡是一项热力学技术。沉降平衡试验在较低的转速下进行，当沉降作用及扩散作用达到平衡时测定分子平衡浓度的分布。在平衡状态下，浓度的分布只确定于质量而及分子的形态无关。溶液中蛋质相互作分析系统术特点1 .独一无二的在溶液中签定蛋白质的方法：由是将蛋白质放在相汇作用而不是孤立的状态中进行探讨，通过检测蛋白质的构象（折梯或伸展）、聚集的可逆性（相互作用系统）、化学计量学（解离状态）和异质性（聚合状态），更接近测定真实生理状态卜的蛋白质：2 .不须要标准品：的测量建立在热力学和流体动力学第肯定律基础上，不须要标准品或校正:3 .非破坏性：样品无需添加任何化学品，离心技术对样品的聚集状态及构象没有破坏性；4 .可检测真正的亚单位比例：及方法仅能供应分子比不同，可以鉴定.及AB（两者同样是1:2）间的差别;5 .多种不同条件的检测：可在不同的值、离子浓度、温度等条件下检测，而（）的检测受缓冲溶液的限制，样品需溶于盐或有机溶剂，以消退蛋白质及介质间的非特异结合：6 .试验成本极低：试验中不须要任何其他试剂或消耗品；7 .实时在线检测：生物分子在相互作用发生时即被检测并实行数据：8 .认可方法f蛋白质聚集是产品产生免疫性的主要缘由，已成为检测蛋白质药物非共价聚集的“金标准”。溶液中蛋白质相互作用分析系统技术指标1 .最高转速为60,000,转速精度为202 .温度设定范围为0-40,0.1步进，精度0.53 .最多样品分别数殳（同时进行试验）：21个4 .样品池选择：2/6/8孔5 .最少进样量：0.0256 .最大产热量少于1.0.（3,400.）7 .备有紫外光及干涉光两种检测系统，检测器可独立及同时操作8 .紫外光检测器：检测范围190-800,0-3汲取率9 .干涉光检测器：检测波长为60010 .专利椭圆形全息衍射光栅及4倍光束系统11 .自动检测基线修正12 .分子量检测范围：10：-10”13 .样品浓度检测范围：52（紫外光），255（干涉光）M.平衡系数检测范围：10'10"M15 .计算机软件限制，全白动检测数据收集及分析16 .可供应多种沉降速率及沉降平衡试验的数据分析方法17 .自动计算样品的分子量，沉降系数，分子结合/解离常数，扩散系数,浓度等溶液中蛋白质相互作用分析系统应用举例1 .异结合系统探讨a）蛋白质及蛋白质相互作用分析超离是探讨溶液中蛋白质间相互作用的重耍检测方法，通过追踪生物大分子在离心场中的沉降，可检测生物大分子在溶液状态下的流体动力学和热力学参数，而无需将蛋白质标记或进行其他化学修饰。沉降速率O和沉降平衡O试验均可用于探讨蛋白质间的相互作用，沉降平衡还可检测蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力，测定的结合/解离常数范围为10-10M.中科院生物物理所利用分析超离探讨神经养分因子3（3）及其受体P75（p75）间的相互作用。神经养分因子O是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，是治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。神经养分因子有两种不同的膜蛋白受体，分别为P75和酪氨酸激崩受体O。神经养分因子通过及这两种受体相互作用调控细胞的发育及凋亡。分析超离的试验结果显示，神经养分因子3、神经生长因子及其受体p75以2:2的方式结合。3及p752:2的结合方式揭示了神经发育过程中375相互作用的活性状态，有助于神经养分因子及受体识别及信号转导机制的探讨，也为以神经养分因子为标阳的药物开发供应了重要的结构基础。b）小分子分析起p?5.3.a.p75:k3:c.:d.375：e.75:t.p75厦门高校生命科学院分析（B）及孤核受体77的相互作用。核受体在很多生物过程（如：细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢及发育等）中起重耍作用。孤核受体77、1和1属于核受体亚家族4（4A），作为转录因子调控靶基因的表达，但还未发觉77的生理性配体。沉降平衡试验的结果显示在320处有光汲取，由于分子量很小，不能沉降；假如结合到一个蛋白质上，则在321波长的汲取随着被结合蛋白质在对应的分子量处沉降而下降。图中及77混合物的汲取图有显著的弯曲，说明可及77相结合。该探讨表明作为77的激烈剂，可特异性地结合到77的配基结合区并促进其转录活性。可能会成为种新的癌症和低血糖症的治疗药物，并为77的功能探讨供应一种新的思路和方法。分析超离在潜在小分子药物的研发中起重要作用Oc)核酸及蛋白质相互作用(R)是一种受干扰素诱导的激酹，在病毒感染初期的免疫反应中起重要作用。真核起始因子2(2)的a亚基为的底物，2a的51位丝氨酸磷酸化阻滞了2的和结合状态的循环，从而抑制蛋白质合成的起始。因此，在病毒感染周期中产生的会激活，以此来抑制病毒和宿主细胞蛋白质的合成。探讨分子，对丁了解宿主抗病毒免疫信号通路的分子机制具有重要意义。下图为利用沉降速率检测20及不同浓度的结合状况：在加入后,沉降(SPOqPtt>s二二®6系数增大，且及蛋白质浓度呈正相关，表明及蛋白质相结合形成发合物，分析超离在探讨蛋白质及核酸的非特异性结合方面具有很大优势。A)0400300200.100.00012345678s*(Svedbergs)8U1(X.03.0.1.0.2.().2 .自结合系线KKl-Tr丁C4M乂TFE沉降平衡或沉降速率试验均可用于检测分子的自结合()。分析超离可用于检测分子在溶液状态下的存在方式是否及晶体结构一样。()是家族的成员，在调控细胞功能中起重要作用。沉降平衡试验结果显示在溶液中的存在状态主要是单体和二聚体，而未检测到三聚体。在IoUM浓度下，的单体和二体等量存在；而在低浓度(<lM)卜.，主要以单体的形式存在，二聚体的存在比例及浓度相关(如下图)。该探讨表明，聚合状态的转换可能参及受体信号通路的调控。分析邺速离心技术是在真正的液相中进行检测的方法，该技术还可检测方法难以检测到的分子豆合物间弱的自聚合()。SGSeHEC08CM«8ucqJ0sq<UoAoBJU.-UeIaM3 .分子OOOa-(15,25,33K,).k。0f(),()分析图为利用分析超离探讨和的结合对70.1构象的影响。70.1分别及和结合后的沉降系数分析，70.1的沉降系数为4.40±0.03S；在存在的条件下，70.1的沉降系数为4.53±0.05S：存在的条件下，其沉降系数为4.72±003S。该结果表明，在及结合后，70.1的沉降系数有5%的增加(其他式验验证该变更并非由蛋白质聚集引起)。因此，及相比，对70.1的构象有较大影响。进一步的探讨表明结合引起的构象变更是和相对位置变更的结果。沉降速率试验可通过测定沉降系数用以分析蛋白质以及相互作用的生物大分子的形态及构象的变更。5.00nHsp701=4.40±0.03SMgATP«4.72±0.02SMgADP-4.53±0.05S0.00.20.40.60.81.0Hsp70-1(mgm1.)f2O.5A,A,s>XI.I44OMIX5S.70.14.72±O02SIt1.I4.5J±ftl>5S4.结合比例探讨检测生物大分子的化学计量学是探讨其功能的基础，目前已有大量通过分析超离探讨蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用的化学计量学报道。高电压激活的钙离子通道(IS和2s)通过调整钙离子的进入参及基因调控、激素释放及突触传递等过程。受系列反馈机制的调整，其中钙离子-钙调蛋白质(2)起中心作用。沉降平衡试验结果显示J1.2一旦合物以2:1的比率结合（八）；在较宽的浓度范围(15T00IIM)和不同的速度F(9000-13000),结合比率仍为2:1(B)。探讨表明,和间的结合可调控的功能。分析超离可以精确测定生物分子的分子量，依据生物分子复合物的分子量进而拟合得到其结合的比例。C3*CaM<Cav1NPrtKMQO>XkCavUPQl09000f4Mn.（八）21.22-1.21002-1.21:1O,2:1O,HOOO.2:2(),9SOOrm.4-l11000rm.13000r4mMi751COnsatrattOn(uM)41C293.()4:2O.a(42.8)4:2(85.6).(B)*质聚集的探讨蛋白质聚集是生物制药中关注的一个重要方面，存在于药物生产、配方研发及存储的各个阶段，它可能影响药物的活性，免疫原性及药代动力学。下图是利用来分析单克隆抗体聚集状况的试验结果。软件用于分析蛋白质的沉降系数。从本图中可以看出，在40C放置了6个月的抗体出现两个降解峰和几个聚集峰。MonomerbOnearmA04AggregatesOOJ0.024681012141618<)4<nc6.蛋白质药物的配方探讨分析超离也可用了药物配方的研发。下图为一抗体样品在各种溶液中的稔定性分析。结果表明，在不同的溶液中，抗体的存在状态有明显的差异。000510152025303540sSvedbergs19mMyd11e,PH6.019mMcitrate.pH6.519mMTris.pH7.019mMMtidine.pH6.519mMphosphate.pH6504-唇<qp>s'n<us)603-02-国内用户应用文献1!Crystal.X,Z,S,H,Z,Y,M,H,Z.J,2010,396(4):1012-1024.2 Ip2a.S,ET.W,K,Y,P,Y,M,KY,Z.J,2010,285(12):9211-9220.3 1(I)1.H,H,H,Z,X,Y,Y,1.,M.J,2010,171(3):291-297.4 .J,S,Y,Y,H,T,K,B,K.J,2010.5 411.X,1.,Z,H,J,X,Y,S.J,2010,285(33):25506-25515.630:AZ,X,W,B,J,Z.J,2009,390(3):530-537.17Z,G.JB,2009,113(37):12462-12465.81.X,G,XC,X,Z.,2009,75(i):1-11.9Q,Z,FJ,M.,2009,30(5):866-872.10B77.,J,S,S,Y,SC,Q.,2008,4(9):548-556.11H,J,Y.,2008,25(1):58-71.12IlJ,T.,2008,454(7205):789-793.135.G,J,J,S,B,N,S,Z,G,J.2007,26(14):34843493.114OJ.J.J,Z,BC,ZJ.,2007,746.15,H,W,T.O,2007,39(8):617-623.16aZ,KQ,CJ,ZJ,WB,1.,KQ,ZY.2007,75(2):367-376.1173.P,K,H,C,1.,C,Y,A,1.,2006,339(3):865-872.18 3aa.SJ,M,K,A.J,2006,139(5):813-820.19 :a.SJ,XG,YY,H,CC.J,2006,281(10):6581-6588.20 :a.H,S,J,GJ,CC.,2006,45(50):15100-15110.国外用户应用文献1(B)aJ,M,G,R,T,W,E,A,A,K,R,JY,M,J,V,M,U,B,B.,2010,465(7295):231-235.SS,R,Z,1.,MA,GF,C,SH,N1.,NJ.,2010,467(7317):K,T1T,NP,DI,W,MC,J,844-848.3 .M,S,SM,P.T,DB,1.W,J.J,2010,29(12):1988-2001.4 .T,N,E,Y,M,N,T,S,Y,J.,2010,467(7319):1123-1127.5 (2+)(V)1.2.EY1CH,F,RJ,F,ES,EY.D1.,.J,2010,29(23):3924-3938.6 .BJ,RA,F,CH,KJ,C,EY.,2010,467(7319):1118-1122.7p120N,SH,S,GY,MJ.1.F,M.,2010,141(1):117-128.A2A,S,1.,Y,P.J,2010,E,1.J,J,C,M,AN,29(7):1176-1191.502-506.10.KD,556-567.HU12JF,A,S,J,0,G,CK,1.S,T,A,O.,2010,465(7297):SC.,2010,142(4):.J1.,2010,10(7):703-713.113.1H4.EI,J.C,H,P,WII.I1.Z,1.A,D.,2010,17(11):1343-1351.13 76.M,N,MII.N,O,A,II,JC,E,P,1.E.J,2010,29(14):2315-2328.14 .J1.,V,S,A,M,K,O,A,AJ,B,G,JA.,M,MF,C,AS,MD,1.A,DM,MG,GP,AE,2009,459(7248):808-813.115C3SH,J,R,K1.,A,D,JD,BJ,P.,2009,10(7):721-727.16AJ,N,M1.,YS,B,T,R,F,PJ,K,SA.,2009,136(3):485-495.17ElC7.CA,RF,DJ,A,T,BA.J,2009,28(13):1953-1964.18 A.T,M,M,F,M.,2009,461(7263):542-545.19 a.1.R,JG,N,PD,A,TJ,R,Y,GJ.,2009,462(7276):1016-1021.20 3.EM,PI1.JA,PM,G,NA.,2009,323(5920):1455-1458.21 .E,WA.,2009,138(5):923-934.22 4.PG,HS,MA,Q,X,Z,D,H,J,2009,28(3):274-285.23 1.HJ,1.,M1.,J,J1.,MS,RE.,2009,137(7):1213-1224.24 1.AV,PF,AA,J,C,KM,RM,P.,2009,457(7230):687-693.25 2B.E,N,H.J,2009,28(24):3910-3920.26 2.R,SK,S,II.AI,J,Y,E,J,2009,28(12):1812-1823.27 :6a4,T,G,K,B,F,P,M,P,A,J.J,2009,28(18):2835-2845.28 a.MK,C,C,R,MII,RM,II.C,Y.,2009,137(1):159-171.29 AD8,.MJ,RH,1.A,CE,TB,TA,AR,HP,MJ,DM,A.,2009,326(5958):1415-1418.30 .C,MC,P,C,M1.J,2009,28(10):1518-1530.31 2.X,U,M,SB,M,TR,M,M,K.USA,2009,106(50):21121-21125.32 .J,E,Wll,ON,P,I,P,NA,S,S.,2009,136(2):352-363.33 a.TR,E,JJ,T,NVrDA,J,R1.,M,I.,2009,459(7249):1015-1018.34 2.D,DE,MA.,2009,461(7261):287-291.35 a.J,M,PC,D,U.,2008,135(4):691-701.36 .Z,JG,N,DW,.,R,XD,IG,M,JA,JA,MD.,2008,135(3):535548.37 .J,N,H,T,1.,E,G1SB,M,D.USA,2008,105(7):2409-2414.38 a.P,X,K,1.,N,S,D,I,KJ,M.,2008,453(7194):548552.39 (U).NA,GM1JE,D,RD,BJ,W.,2008,454(7207):1005-1008.40 :a.AC,P.Fll,A,AW,SA,BE,1.II,S.J,2008,27(4):704-714.41 Hl.M,SM,R,SA,RJ,W.J,2008,27(7):1172-1181.42 .JS,X,G,R,PA,DJ.,2008,455(7215):979-983.43 4.Y,DY,VM,B1.,OR,P,SP,T1.J,2008,27(1):290-300.44 1.KP,M1D,C,TE,F.,2008,132(1):89-100.45 a55.IlII,N,R,J,JH.,2008,322(5901):576-580.46 3p75.Y,P,IlJ,T.,2008,454(7205):789-793.47 .D,A,H.,2008,322(5909):1819-1822.48 11a.R,DJrE,C,SJ,NM,RB,R,1.E,D,T,R1.,M.J,2008,27(12):1779-1789.49 .GN,NR,E,D,Y,K,Y,G,RM,M.J,2008,27(7):1134-1144.50 13G.KM,E,PJ,A,Y,K,RS,II.,2008,452(7183):116-119.51 2R.J,C,OJ,C,RJ,G,A,JC,AB,BE,EY.J,2008,27(1):265-276.52 215a.GJ,JII.T1.,J,K,SC,J,AA.,2008,132(1):79-88.53 .SGfNC,ED,KR,TU.,2008,322(5906):1369-1373.54 ,.E,JW.SM,AV,N,P,K,JN,1.O,HJ,JA,WJ,K,VM,D.,2007,131(4):669-681.55 :.I,StauntonD,1.M,ID.J,2007,26(10):2575-2583.56 1.0V1D,B,1.,1.R,0D,G,T.J,2007,26(22):4768-4776.57 :.T,T,T,S,K,H.J,2007,26(8):2192-2205.58 a.A,II.K,S,K,K,R,Y,M,1.ZJ,BaM,T,A,A,S,M,K,T,S.,2007,129(4):761-772.59 T12.C,A,C,1.,GG,JM.,2007,26(3):299-310.60 p53.HD,F,V,W,V.J,2007,26(14):3463-3473.61 S100B.T,E,A,M,N,B,CW,PM,G.J,2007,26(16):3868-3878.62 .HH,V,PJ,J,S,D,E,DW.,2007,130(2):235-246.63 .T,S1.,G,RH,Y,DT,TA,RA,B1.,2007,447(7146):817-822.64 .MS,C,YY,S,R1B,E,JH.,2007,129(3):485-498.65AA,lR1D,J,EA,E.,2007,131(2):271-285.66DJ,H,J,O,DB,SD,R1.J,2007,26(2):600-612.67 81:a?1.J,F,RJ,WhitbyMC.J,2007,26(7):18911901.68 :.K,1.M.,2007,129(4):655-657.69 a,T,1.,RJ,PH,G,1.,Q,MI,GG,MI,S1.,RA.,2007,8(4):398-408.70 a.CE,3,CA,C1.,SC,I,WC.f2007,130(5):878-892.71 T3a9.E,X,lA,A,A,E,WD,JW,J1.,H,H,TP,JP,SG,SC.,2007,26(3):311-321.72 I:.SK,P,S,K,MM,TJ,KS,PK,J,2007,26(10):2594-2604.