HP1100 高效液相色谱仪验证方案.docx

一.验证方案起草说明高效液相色谱是当今应用最为普遍的分析技术，HP1.C系统通过可重现的溶剂输送、进样、商灵敏度检测及工作站的数据分析,可得到优异的定性和定fit分析结果.为此.本化验室采纳高效液相色谱法，对产品进行纯度检测、分析。整个检测过程从溶剂输送、检测到结果分析，全部由电脏限制，自动完成，溶剂脱气采纳超声波脱气、进样由手动进样器完成，二.验证方案简述高效液相色谱法是用而压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、蚀冲液等流淌相泉入装有冏定机的色谱柱,经进样间注入供试品,他流淌相带入柱内.在柱内各成分被分别后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或枳分仪记录。我们依据高效液相仪的运用要求,参考HP之OQ/PY以及实际须要对仪涔以下关键金数进行测试，以确认HPllOO系列高效液相色进仪是符合设计要求的：1.波长精确度测试2.辄化钛测试.3.检测JB线性测试1.杂讯测试5.柱温箱温度精确性洌试.6.流盘精确性测试.7.手动进样器精确度及交乂污染测试.三.验证报告的编写和批准筌名.1.验证小组成员四验证目的：确认HPllOO高效液相色肃仪符合设计要求，能为中间产品检测供应精确的分析数据，五.验证范围I1 .通过波长精确度测试,弱化被测试，确认uvt测器的波长精确度。2,通过检测器线性测试，确认检刈耦在操作汲取度范用内（最大到2AI）有线性应答关系3 .通过朵讯测试,确认检测器及单元泵系统之系统杂讯操作在可接受的现苞.4 .通过柱ifi箱M度精确性测试，确认柱温箱的黏度在合格规范内是精确的.5 .通过流量精确性测试/精确度测试,确认泵系统所输送的溶剂体积在可接受规范值内,且无大的流量误差，6 .通过进样器精确度及交叉污染测试，确认手动进样器的的确度在UJ接受的标准施困内.各次注射间样品的交叉污染（前次注射所造成的样偏污染）在可接受范围之内。六.名词说明RSD相对标准偏差，本方案中主要是计算标准A前5针的相对标准偏差.RSmiW2.o除相对偏差的行定值,本方案中D是标准A5针校正因子的平均值A及标准B3针校正因子平均值B的相对偏差的肯定值，1居2.依测限（1.OD）试样中被测物能被检测的Ai低川，以信噪比为2：1时，相应浓度确定检测限。定盘限（1.OQ）试样中被测和能被定量测定的最低盘,以信噪比为10：I时,相应浓度确定肽限.W/W用已确定的检测限或定量限及样品检测时的浓度250.OmgZul）比较，得到的比值。分别度R谱图中相邻两峥的分别度。七.相关文件文件名称存放位八.验证详细步骤8.1.验证用仪、设备的校正HPUOO高效液相色谱仪，包括:地元泉：手动进样器：柱温箱：VID多波长检测涔：8.1.1仪4»状况仪器名称仪器型号仪盟厂宓仪器编写仪器精密度高效液相色讷仪HPllOO水银甜度计O-100C"万电子天平AEG120G填表人/日期:8.1.2正用仪寿校正状况和结果仪器名称校正日期校正结果校正有效日期校验单位高效液相色讷仪水银温度计"万电子天平填表人11期:8.2险证用试剂的打算试剂名林来源o.纯水水处理室咖啡因Caffeine标准Iaifl美国惠普部门：填表人/日期:8. 3验证步骤8.3. 1验证的打算工作1）将限流毛细管（HP物料端号5022-2159）安装到装色谱柱位比.（2）起先OQTv程序前24小时打开检测器灯管，达到版住的检刈涔稳定性的状态.（3）将管道A注入纯水。（4）打开分析管柱温控箱的开关将两个热交换擀的温度设定在W）C.（5）把温度去探头安装在柱温箱的热交换器上，（6）打开清洗阀，以SmMmin流速将A管道至少清洗IO分钟以上。（7）关闭泵及清洗阀.（8）调整流最1.omumin的纯水100%通过检验器，接希其他安装程序待系统达到平衡.（9）将OQpV咖啡因标准品依照我I的位置装到手动进样器旁边.8. 3.2波长精确度浦试同理波长的精确度可利用测定一己知其光谱的化合物来加以得知.在特定的波长下，允谱内某一特定波段肯定仝出现，此一波段及特定波长的偏羌则可视为检测器的不确变。本测试所用的标准品为浓度25ugml的物哺因溶液.咖啡因在272mn波长时有艘大汲取，而在244nm有最小汲取，这两个波长即用以验证UV检测器的波长精确度。可交波长枪潮»（VTO）1先在水流过检测器、流淌池时作一空白扫描,然后以自动进样方式将咖啡囚注入流淌池中.作波长扫描，空白光谱会自动拉除，设备HPlK）O系列的单元泵,手动进样潺.配有温度限制之可变波长检测器.W试条件方法：HPoQPV之波长精确性测试 流淌相A：纯水.流量1。mlmin. 柱温箱温度；Wt°.限流毛细管2M0.1211rni.d.标准从43（25ugml）咖啡因，用注射器按编号注射到于动进样器里.运行方法，其结果自动记录并显示测试结果，,试讦估所测得最大/簸小波长及预期的最大/蚣小波长之间的偏差会自动计算，测得结果列入WPV报告中。认可标准及结果名称阳大波长1鼠大波长2最小波长破大偏差标准W2.OnaW2,OnniW2.Oim测定位测得最大偏差结论签名/H期：星核/H期:&3.3HOlBigOxide气化快窝鼠（检窝S）原理悔测器波长校正精确度可以借助测心已知化合物的光谱来和以求取，在特定波长下，光谱应当显示特定的波段,此一波段及给定波长间的差侪,即可视为检测器的不精确度内建具有最大特性汲取的氧化秋谑光器则可用于确定波及精确度.可变波长检外（VTO）I'WD利用卜列敏化轨的：.个最大波长来if侬波长精确度：,360.Snm.418.5nm.536.Inm笈化钦测试会进行内建料化钦泄光器的扫描,求取最大汲取波长及期中波长之差值，为了避开汲取溶剂的效应，此一测试是在流涌池充溢水的状况下诳行，设备HPlI0。系列的电元系，手动进样涔，配花ChemStation限制的可变波长YWD检测器认可标准波氏新确性<2.Onm方法：IIP0Q/PV之粗化伙测试.纯水置于管线A中.100%A.流量lmlain 限流毛细管2M0.12三11i.d.柱温箱之温度：we.窝试环估精确度可由最大汲取时的测量波长及理论波长的偏差来核定.在特定波氏冠围内.测出M小及最大光源演座，并自动及合格规例值作比较，结果将列验证报告中，认可标准及结果要求伯(n三)标准差值测定值(nm)测得差位结论360.8W2.Ona418.S2.Onm536.42.Onm签名/日期：现核/日期; .&4检叁应线性潴试*三当光汲取的星超过某一限度时，汲取检测涔即呈现非.线性现象,造成非线性现象主要缘由是散光.在较高的汲取时,散光变得重要.对检测潺的应答影响就愈重要.畿性的测试方法是在不同样品瓶中放入不同浓度的咖啡因标准品<依序增加浓度).库一样品瓶注入多次，每次注入相同体积，色诺图应当得到面枳愈来愈大的波峥，当这些波岬的面枳（或Ift度）对浓度作图时,应得到一条通过快点的直线.设备HPIloo系列的单元泵,手动进样器.配行泡度限制的可变波长检测器.W试条件.方法：HPOQzPV之检测器线性测试依次：°进样杀：20l.管线A：HP1.C级纯水.流IilI.OmUmin.限流毛细管2M*0.12rmi.d.柱温箱温度：40C.标准品引，S2,S3.B1.口5依序放在手动进样器旁边I、2、3、4、5的位置上.,怆测波长：273nmIN试讦估将所得波峰面积（或高度）时浓仪作图时，应得到一条通过晚点的宜跳，小实上就是强迫通过原点，战性回来的一条校正曲线，此一校正曲戏的相关性（相关系数）即可作为测量检测涔的一种推断依据.此直线斜率的倒数即是列印在校正衣格中的应答因子.理论上每个浓度下的应答因子应是相利的，因此针对这些应答因子所得的相对标准差即可作为测试检冽器线性的另一推断依据.认可标准及结果相关性标准0.999位置样品名针数样品浓度，稣面恨标准浓度结论1咖琲因110.5ugml2咖啡因211.OugZmI3咖啡因315ugl4咖琲因4125ugnl5咖啡因5150ugnl签名/H期：更核/H期:以峰面枳及浓度可作出图如以样品名称：咖啡因Area检冽波长：273nm相关性：公式：Y-mx+bm:b:x:Amounl（nR/ul）YrAreaAmount（ngul）8.3.5杂讯、度稔定性制诚（检窝舞、柱渔箱）A.杂讯一试*3杂讯,偏移及倒黑是检测器的特定性能.在分析极微出化合物时,检测潺的杂讯低及否就显得特殊JR耍，偏移及偏岗值对积分的品质影响最大。紫外线/UJ见光（WViS）汲取检测器的杂讯是来纳STM（ASTME19.09）方法来测试，ASBI杂iH利试是依据美国国家标准协会对测定液相色谱仪所用可变波长检测为之标准程序.为尽可能测得实际的杂讯，选用水作测试溶剂（因为大多溶剂组合中都会用到水，所选用的波长也是落在常用的波长范围内.保格基本上是融度所造成的.其主要的影响是在灯管热机时（约1小时），在进行ASTY杂讯测试时，为避开温位（偏移）的效应，必需至少在24小时前打开灯管。B.度定性窝试原理为测试温度生定性，在杂讯测试时即UJ运用一内部湿度塔测器将湿度不断记录卜来。理论1.在测试过程中,温度讯号应当保持稳定,最大温度及最小温度的差距即可视为温度讯号的稳定性。设备HPnoO系列单元泵，手动进样器,配置有ChemStatiOn限制的VID检测器.窝试条件.方法；HPOQ/PVI.HP1.C级纯水置于管线A中,100%.%ftlmlain,运行时间：20分钟.限流毛细管2M*0.12mmi.d.,柱温箱温度：IOCe试阳首先，格讯号以每一分钟为区隔切割成20等份，每一等份的偏移可由【可来税的税性斜率求得。其次，各时间等份平行城的波峰到波峰杂讯（垂内距周）可视为经偏移校正过的波峥到波峰杂讯.全部波峰对波峰杂讯的平均值即为杂讯值.偏移值是指20个时间等份内平行戏斜率的平均值，偏禹低的求取是将20个时间等份的中点连起来.带杂讯计算方式应用于此线即可求得.所得的基准现次讯、偏移及偏高伯、设定温度的最大偏差值及可接受的标准相比较,自动及OQ/PV系统建立时所定义的合格规范值相比较，测试值会列入OQ/PV报告中。认可标准及结果测试项目接受标准（限制测试结果结论杂讯，温度精确性ASTM杂讯m0.40偏移DnAU0.2漂移mAU/h0.5湿度稳定性左-C0.5温哎稳定性右C0.5签名11期：复核11期:杂讯窝试结果时间杂讯杂讯杂讯源离源移温度稳定性由（分）至分）(6*SD)mAU(Ptop)(ASTM)(InAU)Uh左C右C签名/日期：复核/日期:8. 3.6柱箱度精确性窝试（柱箱）原理温度的精确度是借助一已事先校正过的外来温度计来检测,此留点温度计时在柱温箱热交换器的测愤点上，待系统平衡后，便读取温度计的温度，将此湿度及柱温箱设定温度相比段,并检测两者之差距是否在合格范用内.此测试取25C.2TC.40C.60TC.65C五个温度点.设备HPUOo系列单元泵.手动进样器.配置有ChemStAtion限制的明11）检测器.制试条件.方法：HP0Q/PV纯水置于管线R中.100%A,流晶1.0MlZmin.限流毛细管2M0.1211rni.d.柱温箱温度：40C.评试评估评估包括将外部温度计所量的温僮及柱温箱的设定温度相减,比较差低是否在合格规范值内，认可标准及结果设定温度标准偏差测得温度差值结论左C右I?左T右C左C右C25C30C40C50C55C6。IC65C签名/日期：复核/日期：8.3.7流精现度/精确度,试（泵）及理流量被定义为忖定时间内被送出的体积量：在Hmoo系列的泵系统中,流域则被定义为活塞推送的速度.确认流速的方法是将检测涔的出11端干脆注入一已知也麻的容Iit精.通过测依单位时间内容量瓶HHit的改变而折徵出溶液的体积量.设备HPllOO系列单元泵.手动诳样器.配置有Chemstation限制的VWD检测器.秒表；N0；0011322100ml(校正的)容吊瓶.方法：按设定的运行时间，检冽器波长254nm.依次：ft0.5ml三ir1,OnlZainx2.0mlmin¼3,OalZmin.纯水置于管线R中.流H.0三"min.限流毛细管2M*0.12伽i.d.柱温箱温用：40C。,试讦牯利在不同时间内检测器出口收集到的溶剂量:-一体枳可用以H傥液Jit精确度，测质的流量及其设定伯比较。认可标准及结果认可标准精确性W5.希确度RSmiWO.5%流量精确性测试结果1流域；0.50Oml/分钟压力：297bar序号lfcjR时间(三)瓶Hi-水费(R)水荒(R)温度(C)密度(r1)体积(ml)测得流最(mlmin)12345678910平均滤盘(ml/min)：RSDS签名/日期：交核/H期:流状精确性测试结果-2流量：1.000m"分钟压力：59.8bar用号容量腌重(g)时间(三)瓶用-水重<g)水取温度()密度(g三l)体枳(ml)测得流量(ml/min)12315678910平均流(ml/min)：RSI)签名/日期：复核/日期：流境精确性测试结果-3流量：2.OOOml/分怦压力：118.5bar序号容量版理(g)时间(三)瓶重水重<B)水重<g>温度CC>密度(三l)体枳(ml)测得液fit(ml/min)12345678910平均流景(ml/min)：RSM笠名“I期：复核11期:流比精确性测试结果7用号容量腌重(g)时间(三)瓶用-水重<g)水重<g)温度CC)密度(g三l)体枳(ml)测得流量(ml/min)12315678910平均流1½(ml/min)：RSI)签名/日期：纪核/日期:8.3.8进样4»精确度及交乂污染费成(手动进样4»)A进样器It确度JK理进样器精确度的测试是利用注入多次相同体根咖年因标准品的方法进行。在相同注入体枳下,色诣图应当显示相同面枳的波峰，这些面枳和平均面积的儡差应当愈小愈好，此偏差通常以面枳标准差来表示，标准差及平均面积之比可褥相时标准差，相对标准差即可用以作为精确度的测量,此数值最终再及可接受的标准范附比较.B交叉污染费试原理为测试样品交叉污染的状况.首先注入一高浓度的样品,符充溢于另一样品瓶中的溶剂注入(溶剂及的次高浓度溶液相同),在志向的情形下，其次次注射分析结果不应有样品出现,而其次次注射所出现的样品面枳即可作为交叉污染的测定值指标.设备HPuoo系列单元泵，手动进样器，配置有ChemStaHon限制的VID依测涔，.方法：HPOQ/PV之进样器精确度及交叉污染测试依次位置样品名针数浓度进样贵图谱娘号6空白30.0020uloqpvinuprcOi4珈啡因4625ugml20uloqpvinuprcoi6空白10.0020ulOQPVINUPRC10.检测波长273nm.管规A：纯水./flt1.Oml/Iain.限流毛细管2M/0.12mi.d.,柱温箱温度：40C.标准品M（25ugml/啡因）,放在手动进样塞旁边位置4.HPlX级纯水（空白瓶,），放在手动进样器旁边位置6。,试讦牯每一个咖琳因波峰的面积、高度及停滞时间得到后，计算每一个波峰对平均值的相对标准差（RSD%）认可标准及结果进祥器精确度及交叉污染认可标准测试项目接受标准（限制）测试结果结论进样器粘确度及交叉污染精确度面积（RSI）%）1.000精确度高度（RSD%）2.0交叉污染面积（RSD%）0.2交叉污染高度（RSD%）0.4签名/日期：复核/日期:进祥1»交叉污染试结果名称前次运行当次运行交叉污钱（%>峰面积峰高签名/日期：更核/日期:进样号精确度评试结果运行序号保留时间（Din）峰高mAU)峰面积(mAU)*S)456789平均：S.DRSD95%CI签名/日期：究核/日期:九、验证结果及结论9.1.验证标准及结果测试项目接受标准(限制)测试结果结论1.VwD波长精确性最大波长1精确度nm2.0最大波长2精确度nm：2.0最小波长栉确度InmJ2.02.氧化钛波长波长精确性nn2.03.温度精确性左侧温度精确性边-C2.0右侧温度精确性r2.04.检测器线性相关性0.999005.杂讯，温度精施性ASTM杂讯mAU0.040偏移mAU0.2漂移mAUh0.5温吱稳定性左C0.5温度稳定性右1C0.56.流量精确性/精硬性精确性(%)5.0精确性(VI0.507.进样器精确度及交叉污染精确度面枳(RSD%)1.000粘确度高度(RSD%)2.0交叉污染面积(RSD%)0.2交叉污染高度(RSD%)0.4填表人11期:9.2.结论附录：分析所用方程式回来分析余讯测试及刈试规性时均运用Wl来分析进行评估通常回来分析的方程式农示如下，莲性则由线性方程式得来：其中N=视察值数目Xi=自变数,第其中Yi=因变数，第方程式1系数计第b=-jy其中«=(回来系数产其中i个视察值i个觇察依NNN(x"-x,*匕Nr=lNIWxX*x上ir=lI=I(Ny1-y力*,线性方程式：Y(X)-abx方程式2相对标准差(RSD)的计第标准差：(r-ci-bx,SD=VN2相对标准差:杂讯测试方程式3以线性回来分析求取每个值的偏移Yl=a+bXI*'其中：Y.=讯号之应答X=讯号时间a，斜率.及偏移相等b=偏称代之极距方程式4波峰到波峰杂讯及伯育的求取H,1.4-=(Rsp*j,-Y,)-(Rsp4,nj-Y,)其中NpMI=波峰到波峰的杂讯P、PMN=相对偏移有最大正垂直距黑波蟀i的应答RSPMg=相对儡称皆小及负垂直距愍波峰i的应答yi=波峥i,其偏移线的相对应应答yj=波峰jJW偏移线的相对应应答方程式5ASTM杂讯(NASrM)的计重其中Np1i,i.=第i行循环之波峰到波峰杂讯n=总循环之总数检测器线性测试检测酒线件是借助前向所提线性回来分析的相对标准型来表示.(-aj2标准差=N上V/J-1及SD相等其中Ai=第i个也哗因波峰之面积,高度中停滞时间.AaV=n个试骁咖啤因波峥之面积、高度或停帝时间的平均值。