非洲猪瘟疫苗研究进展及难点.docx

非洲猪瘟（ASF）病毒非洲猪瘟（ASF）病毒T=I89-217外”秋衣夹内A.Vero细胭感条非洲猪勰羯毒的透射电子显然照片.成熟病毒粒子,不成熟的播春粒子和膜中网体是可见的.成熟病毒粒子H径约200nm.（朱淞英国rbrfght研究所）8非洲猪温（ASF）az，nd流病毒粒子图、（朱淞璘士生物信息学研究所）,截至11月7日，全国共发生50多起非洲猪瘟（ASF）疫情。世界动物卫生组织（OlE）在对非洲猪瘟的描述中提到，该病无公布的治疗方法和疫苗。非洲猪瘟疫苗研制难点据了解，目前国内外均没有有效的非洲猪瘟疫苗，主要由其病原生物学特性决定的。非洲猪瘟病毒基因类型多，数量庞大，免疫逃逸机制复杂多样，可逃避宿主免疫细胞的清除。现阶段已研制的一些非洲猪瘟疫苗，虽然能诱导产生一定水平的抗体，但并不具备中和非洲猪瘟病毒的能力，无法达到有效防控非洲猪瘟的目的。记者查询science网站得知，早在1963年，就有研窕人员研制的弱毒疫苗就在西班牙和葡萄牙应用。但使用该疫苗免疫动物后却产生了灾难性后果，用这些减毒活疫苗进行疫苗接种可能是导致低毒力菌株起源的原因。而在1960年1995年间，正是这些菌株诱发了非洲猪痕慢性感染临床症状。五种研制技术的现状中国农业科学院北京畜牧兽医研究所研究人员王西西等的论文表明，自20世纪60年代以来，世界范围内非洲猪温疫苗研制的技术路径有5种，分别是灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗、基因工程亚单位疫苗。灭活疫苗采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难很大。传代致弱毒株、天然致弱毒株和重组致弱毒株等减毒活疫苗，则还需要进一步研窕以确定适合的缺失靶基因及其组合，以研制可诱导保护性免疫反应且没有相应副作用的非洲猪瘟病毒（ASFV）弱毒活疫苗。对于病毒活载体疫苗，2016年美国德克萨斯A&M大学（旧译为德州农工大学）兽医病理学系研究人员将非洲猪瘟病毒抗原基因重组入复制缺陷型腺病毒载体，通过混合免疫后能够诱导体液免疫反应和细胞免疫应答，但仍需通过攻毒保护试验，进一步验证其可行性。在核酸疫苗研究上，西班牙动物卫生研究中心研究者于2012年也开展了ASF核酸疫苗的研究，但该疫苗免疫猪后并不能提供攻毒保护。而基因工程亚单位疫苗尚需研窕鉴定更多的保护性抗原。可见，这5种疫苗均未能实现商业化。疫苗研制在行动2017年底，欧盟发起了针对非洲猪瘟疫苗的创新行动。该行动致力于控制和根除非洲猪瘟，欧盟ASF参考实验室还制作了疫苗开发的潜在策略和可能的研究步骤等蓝图及线路图。该行动开始日期是2018年10月16日，2019年1月23日截止。将主要探讨针对家猪和野猪的ASF安全疫苗的研发。该行动号召受ASF影响的非欧盟地区及国家加入，呼吁动物卫生部门、农业和商业部门等相关研窕机构积极参与研发，同时建议制药企业也参与进来。今年3月底，西班牙国家研究委员会UAM实验室病毒学部研究人员和欧洲联盟ASF参考实验室的研究人员就在Vaccine杂志上发表研究成果，称他们通过构建重组病毒的方法，以毒株NH/P68为骨架，研制了缺失某些特定基因的弱毒活疫苗，能够有效防控ASFV感染，下一步将研究如何提高该弱毒疫苗的安全性和有效性。10月15日，美国农业部农业研究局在FederalRegister网站公示，将授予ZOetiS（硕腾）有限责任公司独家使用2016年12月27日发布的专利号为9528094的“基于MGF基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗的专利。放眼国内，据记者了解，目前国家知识产权局就受理了两项非洲猪瘟疫苗制备的专利申请。其中，2013年6月26日，我国知识产权局就公布了青岛红桥明勤生物科技有限公司（现青岛明勤生物科技有限公司）“一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备的发明专利申请。据该疫苗的专利申请书所述，该疫苗含有非洲猪瘟病毒ASFV主要稳定结构蛋白P72、膜结构蛋白P54、红细胞凝集素的T细胞表位多肽以及纯化标签。经过靶动物仔猪和小白鼠动物实验表明，该发明所述的非洲猪瘟蛋白工程疫苗具有使用的安全性，且疫苗能够诱导显著的细胞免疫反应及体液免疫反应。当记者致电该公司进一步了解相关情况时，该公司相关负责人表示不予置评。国家知识产权局在2017年2月22日公布了英国皮尔布莱特研究所“减毒的非洲猪瘟病毒疫苗的发明专利申请，该发明还提供了包含减毒疫苗及其用于预防ASF的用途。此外还提供了包含该减毒疫苗的鼻内递送装置。“杜绝非法制造和销售所谓能够预防、治疗非洲猪瘟的疫苗、诊断试剂和兽药等行为，未经允许不擅自采集病料、保存病料，不从事疑似含有非洲猪瘟病毒样本的试验活动。"今年9月，在湖北武汉召开的第七届中国兽药大会上，农业农村部畜牧兽医局副局长陈光华表示。由于疫苗研发困难，基于国际非洲猪瘟防控经验，当前首要任务依然是完善非洲猪瘟综合防控措施，同时强化新型免疫技术攻关。由此可见，在世界范围内，非洲猪瘟疫苗的商业化之路仍然长路漫漫。非洲猪瘟疫苗研究进展灭活疫苗传统病毒疫苗可通过病毒灭活和病毒致弱两种方法进行制备。灭活疫苗通过物理或化学手段将病原灭活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。迄今为止，采用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护，包括病毒接种肺泡巨噬细胞以及感染脾组织后匀浆制备的灭活疫苗。虽然用ASF灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体，但很难检测到中和抗体的存在。BIome等研究表明，即使用新型佐剂Polygen或Emulsigen()-D等与ASFV灭活抗原进行配伍，免疫动物后能够诱导产生ASFV特异性抗体，但仍未能提高疫苗的免疫保护效力。这可能是由于产生的ASFV特异性抗体并不具有中和活性，提示细胞免疫在ASF疫苗免疫保护中起重要作用。此外，G6mez-Puertas等研究人员也证实在细胞传代过程中，低代次和高代次的ASFV毒株对中和抗体的敏感性存在差异。鉴于现有研究结果，采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难很大。减毒活疫苗根据减毒活疫苗毒株来源不同，可将ASF减毒活疫苗毒株分为三类：传代致弱毒株、天然致弱毒株和重组致弱毒株。减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但生物安全是其使用的主要限制因素。采用分子生物学手段，可通过基因重组、靶向缺失以及一次性侵染技术来增强减毒活疫苗的安全性。传代致弱毒株ASFV可经过猪骨髓来源细胞、Vero和COS-I等细胞系传代致弱。传代过程中，ASFV致病力逐渐下降，同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙，使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果，免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，许多免疫动物呈现ASF慢性感染临床症状。因此，传代致弱毒株的致病性导致此类疫苗的开发一度受阻。KrUg等利用分离株ASFV-G在Vero细胞中进行传代培养，随着传代次数的增加，ASFV-G在Vero细胞中的复制能力增强，同时在猪原代巨噬细胞中的复制能力下降，病毒毒力逐渐衰减，在传至第110代时完全丧失。家猪接种完全致弱的ASFV-G毒株后并未获得相应保护力以抵抗母本病毒的攻击，表明传代致弱的ASFV安全性较差且很难提供较好免疫保护。天然致弱毒株采用天然致弱ASFV毒株OURT88/3或NH/P68免疫动物后，能诱导产生对同源强毒株的攻毒保护,依据实验动物和攻毒毒株的不同,保护率介于66%100%.研究表明，病毒特异性抗体以及CD8+T细胞在免疫保护中均起重要作用，且OURT88/3毒株产生的免疫保护与病毒特异性IFN-Y产生细胞呈正相关性。采用NH/P68免疫后，猪对高毒力ASFV/1.60感染抵抗力增强。以OURT88/3免疫并用致病性OURT88/1毒株进行加强免疫后，可诱导机体产生针对ASFVI型不同分离毒株的交叉保护，表明研制具有交叉保护的ASFV疫苗是可能的。然而，天然致弱毒株免疫动物后可造成诸多副反应，包括肺炎、流产、死亡等，免疫NH/P68毒株后25%47%的猪呈现慢性感染；免疫OURT88/3后可导致发热、关节肿胀等症状。总之，天然致弱毒株导致的诸多副反应以及存在散毒的可能性等生物安全隐患限制了其在实际生产中的进一步应用。重组致弱毒株采用分子生物学方法,敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答，研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程减毒活疫苗。研究表明一些ASFV毒株在缺失单个或多个毒力基因或免疫抑制基因后，如TK(K196R)>9G1.(B1191.)>CD2v(EP402R)>DP148R.N1.(DP711.)>UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF360/505),缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护(表1)。ASFV编码多种蛋白以干扰宿主免疫系统，己报道的病毒免疫逃逸相关基因包括A2381.>A1791.>A2241.>DP711.>MGF360/505、I3291.、K205R、D96R、DP148R、A276R>D96R和EP153R等，其编码蛋白抑制宿主细胞I型干扰素和ISGS的产生，调控细胞凋亡、蛋白合成和自噬等多种信号通路。由于这些蛋白质可干扰宿主免疫应答，从ASFV强毒株中缺失上述基因有助于增强宿主免疫应答(表1)。安全性和有效性是影响ASF弱毒活疫苗田间应用的重要因素，安全性和有效性与病毒毒株、免疫或感染剂量、病毒接种途径以及接种动物密切相关。因此,致弱毒株保护性的强弱、是否有毒力残留和是否导致持续感染是弱毒活毒株能否成为候选疫苗毒株的重要决定因素。因此，还需要进一步研究以确定适合的缺失靶基因及其组合，以研制可诱导保护性免疫反应且没有相应副作用的ASFV弱毒活疫苗。减毒活载体疫苗己有研究表明，细胞免疫和体液免疫在抗ASFV感染中发挥作用。有学者将ASFV保护性抗原重组入腺病毒或痘病毒载体，以期获得更好的细胞免疫和CT1.反应。1.OkhandWaIa等将ASFVP32、P54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行鸡尾酒式免疫，获得了良好的抗原特异性CT1.反应；之后他们又将ASFVAI51R、B1191.>B6021.>EP402RPRR>B4381.和K205R-A104R共7个ASFV抗原基因，重组入复制缺陷型腺病毒载体，通过“鸡尾酒式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答。上述研究仍需通过攻毒保护试验进一步验证病毒活载体疫苗在ASF疫苗开发中的可行性。核酸疫苗ASF核酸疫苗的研究刚刚起步，通过将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而同时激活体液免疫和细胞免疫应答。Argilaguet等将ASFVP72、p30和p54基因克隆入真核表达载体，制备ASFDNA疫苗，但该DNA疫苗免疫猪后并不能够提供攻毒保护。同组科研人员将ASFVp3O和p54基因与猪白细胞抗原Il的特异性抗体单链可变区基因在真核表达载体中融合表达；接种ASFDNA疫苗后，在没有诱导产生可检测水平ASFV抗体的情况下，能够使部分动物获得攻毒免疫保护，表明细胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用。最新研究表明，根据一个或两个ASFV抗原构建的DNA疫苗并不能诱导较高免疫保护,而免疫ASFV基因组DNA质粒表达文库能够提供60%的保护力，说明有待于发掘更多保护性抗原，以提高核酸疫苗的保护水平。亚单位疫苗ASF亚单位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通过合适抗原传递系统免疫动物。鉴定可以引起强烈的免疫应答的抗原及其表位，有助于开发有效的ASFV亚单位疫苗。研究表明，针对病毒p30蛋白的抗体在细胞水平抑制超过95%的ASFV内化，p72和p54的抗体能够抑制病毒吸附，表明这些蛋白在ASFV感染中发挥作用。用重组p30或p54蛋白免疫猪后可以诱导中和抗体的产生，但不能提供针对急性ASF感染的保护；相比之下，同时免疫p30和p54蛋白或两种蛋白的嵌合体可以提供部分保护。用杆状病毒表达系统制备的ASFV结构蛋白P72、p30和p54等，以蛋白复合物作为抗原免疫动物后仍不能提供有效的免疫攻毒保护，说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。在另一组研究中，1.opera-Madrid等分别以人源293(HEK)细胞表达的ASFVB6461.(p72)>E1831.(p54)和061R(pl2)亚单位抗原，或者痘苗病毒载体疫苗进行首免和加强免疫，获得较好的体液免疫和细胞免疫水平。因此，需要研究鉴定更多的ASFV保护性抗原、开发新型免疫佐剂以及采用DNA首免蛋白质加强免疫策略，以提高ASF基因工程亚单位疫苗的免疫效力。来源：中国动物传染病学报非洲猪瘟疫苗研发有新进展！实验室提供的疫苗原型可以保护100%Georgia病毒实验室攻毒的猪CReSA负责人费尔南多罗德里格斯解释了目前非洲猪瘟疫苗的研发进展我们必须提出的第一个问题是：为什么我们还没有针对非洲猪瘟的疫苗？ASF病毒本身很复杂，就像它的流行病学周期一样，它不仅仅只有一种易感宿主：欧洲的猪和野猪，非洲的情况更复杂，因其有两个天然宿主：钝缘婢和疣猪。但这仅是个人评估，更加复杂的是我们不能稳定和协调的持续研究这一课题，2000年初，因认为该病毒不再是威胁而关闭了当时最好的实验室。而现在我们必须抓紧时间。目前ASF疫苗的研发处于什么阶段?使用何种指导方针?什么时候会有ASF疫苗？无论如何，目前在ASF疫苗研究方面都取得了很大进展，就以下几种疫苗我们比以往任何时候都更接近于成功：经典的灭活疫苗对非洲猪瘟病毒没有效果。至少就至今为止的配制方式而言，很可能是由于其无法产生细胞毒性T细胞，这是清除感染细胞所必需的。减毒活疫苗。无论是采用经典方法还是通过基因操作，它们都能提供很好的保护水平，至少对同源毒株是如此。至今，这一战略被认为更接近市场，几乎所有的研究小组都寄希望于此，正如最近由欧盟委员会专家起草的一份报告所示。这并不容易，因目前的原型，包括美国农业部在普拉姆岛实验室开发的原型以及通过SeveroOchoa分子生物学中心和CreSA-IRTA合作获得的原型都需在不久的将来进行完善，主要是从它们的安全性和DIVA能力（可区分疫苗接种和自然感染动物）的角度出发。由USDA-ARS和CreSA-IRTA组成的联盟保证了原型的优化。企业的兴趣以及欧盟的资金支持让人们对5到10年内市场上出现减毒疫苗的可能性持乐观态度，谨记该最后期限是由对市场营销知之甚少的乐观科学家提出的。减毒与亚单位疫苗。欧洲委员会的同一份报告鼓励我们继续以亚单位为基础开展未来的疫苗研究。病毒非常复杂，有超过200种不同的蛋白质，难以进行体内给予，以使其最佳地递呈给免疫系统，在商品化阶段更加保守。尽管其在安全性和可追溯方面具有巨大优势，但我们必须考虑到目前为止其针对致命ASFV菌株所表现出的低效率。我们必须继续共同努力，鉴定保护病毒的抗原和负责保护的免疫机制。总之，基础研究需要更多的投入。根据目前可用的信息，疫苗可以达到预期的效果如何？将实验室结果推广到现场总是很困难。我们今天唯一可以说的是，我们实验室提供的疫苗原型可以保护100%GeOrgia病毒实验室攻毒的猪，此处的保护理解为避免死亡的能力（对照动物在10天内死亡）。与对照相比，一些动物在短时间内在血液和鼻分泌物中检测到的病毒量减少。该疫苗必须实现哪些目标？关键问题是安全级别和DIVA能力。我们不能忽视它是一种活疫苗，故它必须在极大的安全保障下使用。基于亚单位的疫苗的使用将更容易且限制性更小。尽管注射给药很可能会被业界更好地接受，但我们不应忘记口服给药可通过诱饵接种野猪，与现在正在测试的经典猪瘟结核病疫苗类似。考虑到这种疾病在过去几年中的影响，是否有足够的全球资源用于研究？现在可能更多地关注这个问题，并且为此分配了更多的资金，但如果不长期持续下去，就没有任何意义了。