HDAC3介导线粒体驱动的IL 1β依赖性炎症机制.docx

巨噬细胞是先天免疫的关键调节因子，负责广泛的炎症调控过程，如微生物感染诱导的急性炎症和热量过量诱导的慢性炎症等。代谢途径和代谢物不仅为巨噬细胞的生长和存活提供能量和底物，而且对巨噬细胞的效应功能和极化具有指导作用。同时，巨噬细胞的激活与线粒体生物发生和氧化线粒体代谢关系较为紧密。巨噬细胞能够获得线粒体的适应性，并与之联系重塑免疫功能，但相关代谢信息和关键调节机制目前仍不清楚。研究人员揭示了组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)在巨噬细胞中通过非组蛋白去乙酰化调控I1.-IB生成的具体机制。HDAC3转位到线粒体去乙酰化和抑制线粒体脂肪酸氧化关键酶HADHA,并作为一个控制节点，调控线粒体适应性和维持其对I1.-IB依赖性炎症的适应之间平衡。研究速读1、HDAC3参与巨噬细胞炎症调控为了揭示HDAC3在炎症调控中的作用，研究人员构建了Hdac3条件敲除小鼠。脓毒症模型及肥胖诱发的2型糖尿病模型研究揭示HDAC3可能通过促进炎症小体依赖性caspase-1的激活促进1.PS和代谢应激诱导的体内炎症反应。进一步的研究指出HDAC3特异性地促进N1.RP3依赖的CaSPaSe-I成熟和I1.-I的产生；在I1.-IB成熟过程中，HDAC3对线粒体获得适应至关重要，SIM成像技术显示HDAC3通过转位到靠近线粒体膜端发挥作用。2、HDAC3去乙酰化HADHA并抑制其酶活为了寻找I1.-I生成过程中HDAC3的潜在底物，研究人员采用TMT标记定量蛋白质组学方法对1.PS诱导的野生型和1.yZ2-cre-Hdac3ff小鼠的腹腔巨噬细胞进行了蛋白组学和乙酰化修饰组学研究，共鉴定到了3,622个特异性的乙酰化位点。Go分析表明，线粒体FAO多酶复合物和HADHA分别在“细胞组成”和“分子功能”模块显著富集。研究人员通过一系列的位点突变实验，最终确定HDAC3去乙酰化HADHA的K303位点，并证明这一位点的乙酰化修饰可以通过影响HADHA与底物的结合从而抑制其酶活性。A尽管一些研究己经将HDACs抑制剂与炎性疾病联系起来，但由于HDACs的更杂性，相应的精确靶点仍旧难以确定。此篇研究揭示HDAC3炎症调控新机制，指出巨噬细胞炎症小体活化过程中，HDAC3转位到线粒体去乙酰化和灭活线粒体脂肪酸氧化关键酶HADHAo文章揭示HDAC3可以作为一个控制节点，在获得线粒体适应性和维持其对I1.-IB依赖性炎症的适应之间进行平衡。蛋白质组学的技术发展为HDAC3更多的潜在机制研究提供了保N1.RP3InflammasomeActivation组蛋白脱乙酰酶3与线粒体结合，通过调节脂肪酸氧化来驱动I1.-I依赖性炎症免疫细胞功能取决于线粒体控制的特定代谢程序，包括营养物氧化、大分子合成和翻译后修饰。线粒体适应与急性和慢性炎症有关，但代谢线索和精确机制仍不清楚。在此，我们揭示组蛋白脱乙酰酶3（HDAC3）对于通过非组蛋白脱乙酰化塑造巨噬细胞中11.-I产生的线粒体适应至关重要。在体内，HDAC3通过增强N1.RP3依赖性caspase-1激活来促进脂多糖诱导的急性炎症和高脂饮食诱导的慢性炎症。HDAC3在受刺激的巨噬细胞和受外源脂肪酸支持的限制性脂肪酸氧化（FAO）中配置脂质谱，以使线粒体获得适应和去极化。HDAC3并没有影响核基因表达，而是转移到线粒体，使一种FAo酶（线粒体三功能酶亚基）脱乙酰化并使其失活。HDAC3可能作为一个控制节点，在获得线粒体适应和维持其对I1.-S依赖性炎症的适应性之间取得平衡。N1.RP3InflammasomeActivationHDAC3KOHDAC3WTHealthyMitochondriafl-oxidationmtROSWmitomtoInfiammtoryCytokmereleaseCytokmereleaseFragmentedMitochondhaFissionoxidationmtROSMitochondrieAdaptationTN1.RP3inflammasomeactivationN1.RP3InflammaSOmeactivation实验结果1骨髓细胞中的HDAC3消除可改善急性和慢性Caspase-I依赖性炎症HDAC3在哺乳动物发育和生理学的许多方面都是必需的，但它对巨噬细胞介导的炎症的贡献在很大程度上尚不清楚。先前的一项研究发现，作为表观基因组调节剂，HDAC3负责干扰素-P诱导第二波基因转录，但不负责体外1.PS刺激后炎症基因（如Illb和Tnf）的初始诱导。为了研究HDAC3对体内炎症的作用，作者生成了骨髓细胞中缺乏HDAC3的1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠。使用两种体内急性和慢性炎症模型：1.PS诱导的脓毒症和饮食诱导的2型糖尿病（T2D）。在脓毒症模型中，作者发现1.yZ2-cre-Hdac30f小鼠的肿瘤坏死因子（TNF-a）的产生没有受到影响，但血清I1.-1和I1.-18的水平显着降低（图1A）。因为作者使用1.yz2-cre同窝仔猪，这表明这些影响不是由于溶菌酶M拷贝的差异造成的。此外，巨噬细胞中HDAC3的消耗显着提高了接受1.PS攻击的小鼠的存活率（图lB）0鉴于炎症小体在I1.-l和I1.-I8的caspase-1依赖性成熟中的关键作用，作者进一步用基于caspase-1荧光活性的探针F1.lCA（FAM-YVAD-FMK）进行染色，发现caspase-1减少与对照小鼠相比，1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠腹膜和脾脏巨噬细胞的激活（图IC）。在T2D模型中，作者给小鼠喂食高脂肪饮食（HFD）或正常饮食（ND）14周。1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠在喂食时体重和葡萄糖耐量没有变化，但体重增加减少（图ID）和内脏肥胖（图IE）,葡萄糖耐量改善（图1F）,并且降低与HFD条件下的对照组相比，胰岛素对血糖的反应（图1G）。此外，1.yz2-cre-Hdac30f的附睾脂肪基质血管成分（SVF）中CDllc+（Ml样）巨噬细胞的比例和CDllc+（Ml样）：CD206+（M2样）巨噬细胞的比例降低HFD条件下的小鼠（图IH和IDo鉴于caspase-1介导的I1.-IP和I1.-18产生在胰岛素抵抗和T2D进展中的关键作用，作者还注意到较低与对照组相比，HFD在1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠的SVF中诱导caspase-1激活（图1J）,以及SVF中巨噬细胞的F1.ICA染色。总之，这些结果表明HDAC3可能通过促进炎症小体依赖性CaSPaSe-I激活来支持1.PS和代谢应激诱导的体内炎症。实验结果2HDAC3特异性促进N1.RP3依赖性Caspase-I成熟和I1.-IP产生为了研究HDAC3是否有助于炎症小体的激活，作者用不同的激动剂处理1.PS引发的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）o与对照小鼠相比，来自1.yz2-cre-Hdac317f小鼠的BMDM显示由不同激动剂（包括ATP,尼日利亚霉素、铝盐（明矶）和尿酸钠（MSU）晶体）触发的N1.RP3炎症小体激活受损，I1.-S受到抑制即可证明和caspase-1成熟（图2A）以及I1.-IP和I1.-18分泌（图2B）。相反，分别由肠鼠伤寒沙门氏菌感染和聚（dA：dT）转染触发的N1.RC4和AIM2炎症小体的激活不受HDAC3耗竭的影响，表明HDAC3对N1.RP3激活的影响具有特异性（图2C和2D）。此外，N1.RP3依赖性ASC寡聚化和ASC斑点形成也受到损害（图2E和2F）0重要的是，1.PS诱导的pro-I1.-l表达和TNF-分泌并没有因HDAC3耗竭而改变（图2A-2C）。此外，RNA测序（RNA-seq）和定量蛋白质组学分析表明，N1.RP3炎症小体的基本成分的表达基本上不受影响（图2G）。这些结果表明，HDAC3特异性促进N1.RP3炎症小体的激活阶段，而不影响其基本成分的表达。RGFP966是一种选择性HDAC3抑制剂，浓度高达15M时不会有效抑制任何其他HDACo引人注目的是，低于15MRGFP966以剂量依赖性方式抑制不同激动剂触发的N1.RP3激活，抑制I1.-l和caspase-1成熟（图2H和2D、I1.-S和I1.-18分泌（图2J）、ASC寡聚和斑点形成（图2K和21.）以及细胞焦亡。在人外周血单核细胞（PBMC）中也获得了类似的结果。此外，在ATP之前预处理RGFP96630分钟足以抑制I1.-S的产生,但不能抑制TNF-,这表明它对此过程具有迅速的抑制作用。RGFP966对N1.RC4和AIM2炎症小体的激活没有影响（图2M）。总之，这些结果表明HDAC3特异性促进巨噬细胞中N1.RP3依赖性I1.-IB和I1.-18的产生。实验结果3HDAC3重新连接脂质代谢并限制由FAO驱动的OXPHoS产生I1.-1细胞代谢在支持炎症巨噬细胞功能中发挥着关键作用。1.PS诱导的炎症细胞因子的产生和caspase-1介导的I1.-S（和I1.-I8）成熟是代谢重编程严格控制的两个重要阶段。作者测量了来自1.yz2-cre-Hdac3ff和对照小鼠的BMDM在包括这两个阶段的较长时间内的细胞外酸化率（ECAR）和细胞耗氧率（OCR）的实时变化。1.PS刺激导致ECAR增加和OCR逐渐下降，而BMDM中这些都不受HDAC3耗尽的影响（图3A和3B）令人惊讶的是，ATP刺激导致OCR短暂升高，这种升高在HDAC3耗尽的BMDM中持续存在，但在对照组中则不然（图3B）o值得注意的是，这种持续的OCR因对依托莫昔尔（一种针对肉碱棕桐酰转移酶1（CTP-I）的药物性FAO抑制剂）的反应而急剧下降（图3B）,这表明OXPHoS在I1.-l成熟过程中的升高FFA可能加剧了HDAC3的缺失。此外，作者发现在I1.-S成熟过程中，与对照组相比，RGFP966或HDAC3消耗导致最大OCR、备用呼吸能力（SRC）和耦合呼吸增加（图3C和3D）。鉴于改变的FAo通量可能导致细胞脂质谱的变化，作者进行了代谢组学分析，发现巨噬细胞中长链而不是中链和短链酰基肉碱减少（图3E）以及乙酰肉碱增加与对照小鼠相比，来自1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠的结果，证实了在缺乏HDAC3的情况下，FAO通量增加。为了扩展FAO支持的HDAC3限制OCR的发现，作者使用棕根）酸酯-BSA作为外源性FAO底物进一步测量了OCR。引人注目的是，在1.PS引发的BMDM中，HDAC3缺陷在棕桐酸酯-BSA存在的情况下显着增加了OCR（图3F）,但在BSA对照中没有增加，这表明HDAC3在I1.-IP期间优先限制由外源脂肪酸支持的FAO成熟。与这一假设一致，内源性中性脂质储备的BODlPY493/503染色显示1.yz2-cre-Hdac3ff和野生型小鼠的BMDM之间没有差异。相比之下，作者使用荧光素标记的（BODlPY-F1./Cl6）或稳定同位素标记的（palmitate-D3l）棕檎酸酯类似物来测量外源脂肪酸的摄取，两种策略都表明HDAC3消耗导致脂肪酸增加I1.-l成熟期间的摄取（图3G）。与外源脂肪酸摄取增加一致，HDAC3耗尽的巨噬细胞中长链脂肪酸转运蛋白CD36的表面表达增加。此外,我们研究了FAo驱动的OXPHOS在I1.-IP生产中的作用。乙酰肉碱是肉碱的一种高生物利用度形式，可促进FAo和线粒体呼吸，显着抑制CaSPaSe-I和I1.-IP的成熟以及I1.-IP的分泌（图3H）。此外，复合物I抑制剂鱼藤酮和杀粉虫素A通过HDAC3耗竭可抑制caspase-1成熟和I1.-IB产生（图31）。总之，这些数据表明，由于外源脂肪酸支持的FAO,HDAC3依赖性线粒体呼吸限制是最佳I1.l生产所必需的。HDAC3对于线粒体在I1.-IP成熟过程中获得适应至关重要I1.-l的成熟受到线粒体适应性和动力学改变的严格调控，但上游代谢线索（尤其是FAO）基本上尚未得到研究。据报道，FAO驱动的线粒体呼吸和SRC有利于线粒体稳态。使用共聚焦成像,作者发现HDAC3耗竭导致1.PS引发的BMDM在ATP刺激后细胞形状和大小发生形态学变化，但在引发状态下不会发生变化（图4A和4B）。引人注目的是，在ATP刺激后，巨噬细胞中HDAC3的消耗阻止了线粒体裂变（图4A和4B）o值得注意的是，作者观察到HDAC3定位于细胞质和细胞核中，并且HDAC3的很大一部分在ATP刺激后与线粒体标记物共定位（图4A和4B）为了进一步确认通过传统共焦成像获得的线粒体动力学的这些变化，作者使用了Airyscan超分辨率显微镜，这是研究线粒体裂变和融合动力学的强大工具。ATP刺激后线粒体更加破碎，但HDAC3耗竭或RGFP966在很大程度上阻断了这些线粒体动力学并维持其完整性（图4C、4D）除了形态学变化外，作者还发现HDAC3通过特定耗竭或RGFP966丧失功能，阻止了ATP诱导的mtR0S产生和线粒体去极化（线粒体膜电位mito降低）（图4E、4F）。总之，这些结果表明HDAC3对于巨噬细胞在I1.-IB成熟过程中获得线粒体适应至关重要.实验结果5HDAC3在I1.-IP成熟过程中易位至线粒体HDAC3的功能已被广泛描述为与细胞核中的NCoR和SMRT形成特征明确的多蛋白复合物，使组蛋白脱乙酰化并导致基因沉默。因此，作者首先考虑HDAC3作为转录调节因子调节脂质代谢和线粒体动力学的可能性。然而，RNA-seq数据的基因集富集分析（GSEA）和定量蛋白质组学分析显示，巨噬细胞中参与FAO和脂肪酸代谢的基因的mRNA和蛋白质表达变化有限（图5A、5B）o参与与FAo相关的其他代谢途径的基因的表达，包括TCA和ETC也基本上不受HDAC3耗竭的影响（图5C）。此外，线粒体动力学受到几个关键调节因子的调节，但这些基因的表达也不受巨噬细胞中HDAC3耗竭的影响。这些结果表明，HDAC3耗尽的巨噬细胞中FAO和线粒体动力学的改变可能不依赖于相关基因表达的直接调节。接下来作者考虑了巨噬细胞中HDAC3的非酶促作用或非组蛋白脱乙酰化的可能性。值得注意的是，用野生型HDAC3逆转录病毒转导1.yz2-cre-Hdac3ffBMDM可挽救caspase-1激活和I1.-l产生，但两个脱乙酰酶死亡的HDAC3突变体H134/135A和Y298F失败（图5D）o在这些实验中TNF-的产生未受影响（图5D）0因此作者推断HDAC3对I1.-I。产生的影响仍然需要其脱乙酰酶活性。接下来作者探讨了HDAC3是否通过非组蛋白脱乙酰作用发挥作用。考虑到HDAC3可能定位于线粒体（图4B）,作者进行了超分辨率和3D结构照明显微镜（SlM）成像，以更精确地检查HDAC3的易位。引人注目的是，在ATP刺激后，很大一部分HDAC3易位到靠近碎片线粒体的区域（图5E）0此外，为了量化这种易位，作者进行了原位邻近连接测定（P1.As）,发现ATP刺激增强了HDAC3与线粒体外膜蛋白TOM20的空间近似（图5F和5G）。使用超薄冷冻切片方法和免疫金染色，作者证实了HDAC3定位于线粒体，主要靠近线粒体膜（图5H）0与这些成像数据一致，HDAC3在ATP或尼日利亚霉素刺激后在线粒体部分中积累（图51）。总的来说，HDAC3可能通过易位至线粒体来发挥其在I1.-IB产生中的作用，而不是调节参与线粒体FAO和动力学的基因转录。实验结果6HDAC3使FAO酶HADHA脱乙酰并失活为了在I1.-IB生产过程中寻找HDAC3的潜在底物，作者使用来自野生型和1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠的1.PS引发的腹膜巨噬细胞在ATP刺激下进行了串联质量标签（TMT）的定量蛋白质组学方法。作者鉴定了3,622个独特的乙酰化位点，其中3,224个进行了定量（图6A）0接下来，作者关注由于HDAC3耗尽而丰度增加超过1.2倍的乙酰化肽，并进行了基因本体分析。引人注目的是，最丰富的“细胞成分”术语是线粒体FAo多酶复合物，而“分子功能”术语最丰富的是HADHA（图6A）。HADHA是一种线粒体膜酶，催化线粒体FAO的中间两个步骤（图6B）,因此，作者考虑了HDAC3使HADHA脱乙酰以调节其能活性的可能性。为了测试这一点，作者首先用曲古抑菌素A（I类和II类HDAC抑制剂）和烟酰胺（III类HDAC抑制剂）处理表达F1.AG-HADHA的HEK293T细胞，以广泛抑制内源性HDACo通过泛抗乙酰赖氨酸抗体检测，乙酰化HADHA显着增强（图6C）o蛋白质乙酰化状态由赖氨酸乙酰转移酶（KAT）和脱乙酰酶控制。为了寻找负责HADHA乙酰化的潜在KAT,作者表达了每种最常见的KAT,并发现只有CBP（CREB结合蛋白）增强了HADHA乙酰化（图6D）o重要的是，HDAC3大大降低了CBP介导的HADHA乙酰化（图6E）,表明HDAC3可能是主要的HADHA脱乙酰酶。为了进一步研究HDAC3对内源性HADHA的去乙酰化作用，作者使用腹膜巨噬细胞，发现由于HDAC3耗尽而导致HADHA乙酰化增加（图6F）。此外，ATP刺激导致HDAC3和HADHA之间的内源性相互作用（图6G）P1.A也证实了HDAC3和HADHA之间的空间近似（图6H）接下来，作者构建了一系列HADHA缺失突变体，发现缺乏氨基酸201-300和301-400的突变体极大地损害了CBP介导的HADHA乙酰化（图61）,表明乙酰化位点位于氨基内。酸201TO0。该区域有25个赖氨酸残基，作者将每个赖氨酸突变为精氨酸以确定乙酰化位点。引人注目的是，与其他突变体相比，K303R完全失去了乙酰化作用（图6J）,这表明赖氨酸303是HADHA上的主要乙酰化位点。此外，质谱分析证实了赖氨酸303的乙酰化。为了研究乙酰化诱导的酶活性变化的潜在结构机制，作者建立了野生型HADHA及其与底物C14-烯酰辅酶A（CoA）对接的K303Q/R突变体的同源模型。引人注目的是，尽管K303的突变以变构方式诱导了HADHA的细微构象变化，但它们导致了底物的不同结合构型（图6K）。此外，与WT和K303R（脱乙酰化模拟）突变体相比，计算出的底物与K303Q（乙酰化模拟）突变体的结合能显着增加（图61.）,这可能导致更高的结合亲和力和增加的酶促反应。为了在计算机预测中测试这一点，作者评估了1.PS引发的腹膜巨噬细胞中内源性HADHA的酶活性，如前所述。尽管HADHA的蛋白表达没有变化（图6F）,但作者发现1.yz2-cre-Hdac3ff小鼠的巨噬细胞中HADHA的酶活性在ATP刺激后增加，但对照小鼠的巨噬细胞中没有增加（图6M）,这表明HDAC3介导的去乙酰化在I1.-IP成熟过程中使HADHA失活。作者还将N1.RP3炎症小体激活后的野生型和1.yz2-cre-Hdac3ff巨噬细胞的细胞裂解物与RGFP966混合，发现HDAC3抑制可以显着增加体外HADHA酶活性。此外，作者在Hadha敲除（Ko）ASC-GFP-RAW267.1细胞中重建HADHA突变体，发现与野生型对照相比，HADHA-K303Q突变体表现出酶活性显着增加，而K303R突变体稍微降低了它（图6N）。此外，HEK293T细胞中异位表达的HADHAK303Q突变体也显示出类似的结果。作者的数据表明赖氨酸303的乙酰化对于调节HADHA酶活性是必要的。总的来说，这些数据表明HDAC3使HADHA脱乙酰并降低其在I1.-IP产生过程中重新连接脂质代谢的催化活性。Anr0.<MC¾1.F一|-2UBBBSI«BKW3实验结果7HDAC3介导的线粒体适应I1.-IP生产需要HADHA为了确定HADHA在调节HDAC3I1.-l产生中的作用，作者首先用特定的小干扰RNA（siRNA）沉默腹膜巨噬细胞中的HADHA,并发现HADHA敲低损害了HDAC3对CaSPaSe-I激活和I1.-IP产生的抑制耗尽，但N1.RP3独立的TNF-产生不受影响（图7A和7B）。此外，为了直接评估FAO在N1.RP3炎症小体激活中的作用，作者生成了HadhaKOWCptlaKOASC-GFP-RAW267.1巨噬细胞。作者发现，FAO通过HADHA或CPTlA消耗进行的阻断导致I1.-IP和caspase-l的成熟增加（图70。更重要的是，为了确定HADHAK303的乙酰化是否对N1.RP3炎症小体激活有影响，作者用野生型HADHA及其K303Q/R突变体重建HadhaKOASC-GFP-RAW267.1巨噬细胞，并刺激这些细胞中的N1.RP3炎症小体。与空载体对照相比，除了野生型HADHA减少了I1.-IP产量外，与野生型HADHA相比，HADHA-K303R显示出显着更高的I1.-l产量以及pro-caspase-1裂解，而K303Q显示出I1.-10减少生产和裂解（图7D和7E）。为了证实通过遗传策略获得的结果，我们还用曲美他嗪（TMZ）处理巨噬细胞，曲美他嗪是由HADHA和HADHB组成的线粒体三功能酶的特异性抑制剂，阻断FAo的晚期阶段。同样，TMZ很大程度上挽救了因HDAC3耗尽而导致的caspase-1激活和I1.-IP产生抑制（图7F和7G）.此外，TMZ治疗在I1.-IP成熟过程中恢复了HDAC3耗尽的巨噬细胞的线粒体裂变（图7H）以及其他线粒体适应，包括mtR0S生成和线粒体去极化。总的来说，虽然也可能涉及其他潜在机制，但HADHA的限制对HDAC3产生I1.-IP的调节有很大贡献。最后，作者试图提供HDAC3与人类I1.-IP依赖性炎症之间的联系的证据。作者首先使用痛风患者的滑液细胞，因为痛风是一种与I1.-I密切相关的炎症性关节炎。除了MCC950这种经过充分研究的N1.RP3抑制剂之外,作者发现RGFP966也剂量依赖性地抑制从痛风患者新鲜分离的滑液细胞中I1.-IP的产生。此外，作者还获取了许多个体的网膜脂肪组织样本，以检查HDAC3与脂肪内低度炎症之间的相关性。用荧光标记的抗CD68和抗HDAC3对这些组织的冷冻切片进行染色，揭示了HDAC3的巨噬细胞定位以及这些样本中CD68和HDAC3染色信号之间的正相关性。很难测量这些样本中的I1.-l成熟度和HDAC3蛋白表达，但我们发现SVF中I1.lB和HDAC3转录物之间存在有趣的正相关性，这可能反映了HDAC3与脂肪组织中慢性炎症的关联。人类样本的这些结果表明，HDAC3可能有助于人类I1.-IP依赖性炎症的进展，并表明HDAC3作为治疗炎症性疾病的潜在靶点。