WST 230—2024实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南.docx

ICSI1.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T2302024RVK/T230-2002实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南Guidelinesforimplementationofreal-timefluorescentpolymerasechainreactioninclinicalIabomtories.2024-05-09发布2024-11-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布目次Wn1I莅国I2规莅性引用文件I3术语和定义J4缩略谓35样木采柒和处理36方:2.77污染预防和控制88质址管理IO9结果判读和报告1510实验室生物安全16Il临床适用范困16附录A（资料性附录）常用实时荧光PCR技术方法17时双B（资料性附录）实时英光PCR技术临床适用他国18参考文献21本标准为推荐性标准。本标准代替WS/T230-2002临床诊断中聚合由燧反应（PCR）技术的应用,与US/T230-2002相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如"一更改了“范Ifr部分（见第1章，2002年版的笫1章），较WS/T2302002将所述技术范明由“PCR”缩小为“实时英光PCR”;一一增加了“规范性引用文件”部分（见第2章）：一一更改了“术谱和定义”部分（见第3章,2002年版的第2聿）；一一地加了“缩略语”部分（见第4章）；一一将“标本的收集、运输、处理和存放”部分更身为“样本采集和处理”，对2002年版相关内容进行细化补充后纳入（见第5题,2002年版的第5章）；在“方法”中增加了针对实时戋光PCR技术的扩增体系、扩增反应内容，删除了该技术以外的其他PCR产物分析方法（见第6帝，2002年版的第I章）：一一在“污染预防和控制'中增加了污染的处理与控制要求内容（见第7章，2002年版的第6段）：一将“质量控制”部分更改为“质量管理”，增加了人员及实脸室、设箸管理要求、方法性能命证、室内质控、实验室同比对要求内容（见第8章，2002年版的第7章）；-ft"结果的判读、报告和解群”部分更改为“结果判读和报告”.增加检测方法局限性、结果报告要素、检测结果解择内容（见第9章，2002年版的第8曲）：一一增加了“实验室生物安全”部分（见第10章）：一一将“用途”部分更近为“临床适用他国”，删除了过箱实验、诊断实验、蛤证实聆内容（见笫11章，2002年版的第3章）；一删除/2002年版“附录”内容（见2002年版的附录A“定IRPCR技术"、附录B“对生产厂商的要求和建议”）：一一增加了资料性附录A常用实时荧光PCR技术方法”（见附录笛：一一增加了资料性附录B"实时荧光PcR技术临床适用范围”（见附录B）.本标准由国家卫生健康标准委员会峪床检蛤标准专业委员会负责技术申宣和技术杏询，由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负由协询性和格式申杏，由国家TJ生健康委M会医政司负击业务管理、法规司负货统筹管理.本标准主要起草单位：发旦大学附属中山医院、昆明医科大学第一附属医院、中国科学技术大学附M第一医院、发旦大学附属华山医院、北京大学人民医院、浙江省人民医院、中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心.本标准主要起草人:潘柏叭郭玮、段勇、沈佐君、关明、赵晓涛、荣向民、邱茂锋、王格丽.本标准于2002年首次发布，本次为笫一次修订。实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南1三a本标准规定了实时荧光磨合酸链反应在临床实验空应用中的样本采集和处理、方法、污染预防和控制、质年管理、结果判读和报告、实的室生物安全、临床适用范国等要求，本标准适用于全国各级各类医疗卫生机岗及医学检验实验室开展核酸犷剂基因定性及定属检测.本标准不适用于基于核酸柒交、核酸忸温扩增、基因测序等技术所开展的检测。2祝范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款.其中.注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修通单)适用于本标准.GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则GB/T4097-1核酸样本侦IiU平价方法JJF1874(自动)核酸提取仪校准规冠JJF1527聚合触跳反应分析仪校准规范WS233病原激生物实脸宓生物安全通用准则WST348尿液标本的采集与处理WS/T414空间质信评价不合格原因分析WST640临床微生物学检紧标本的采续和转运WS.'T661峥脓血液标本聚集指南3*BWtX下列术语和定义适用于本标准.3.1XMUtfiPolyaerasechainreaction;PCK一种利用人工合成的寡核甘酸作为引物介导的DNA目标序列特异性解优扩增技术.当存在模板、底物、引初和酎热DM崇合院时，通过调节反应温度引导多次“变性-退火-延伸”反应循环，可令痕DM模板扩增数百万倍.3.2实时55光JR合反应real-timefluorescencepolymerasechainreaction：rcal-tinwPCR在PCR反应体系中引入荧光基团，利用荧光信号的松累实时监测将个PCRia程，通过连续监测绘制反应动力曲线，从而时样本中被扩增模板叭A的初始含量B行计算“该技术包含定性和定境检测，常以qPCR(qantitativcpolymerasechainreaction)代表定量检测.3.3反转录reverseIraKcriptiaizKF以RXA成做为模板，在反转录的催化下合成互补IAA(UPclXA)的过程.3.4模板template红制或转录.反转录过程中川来产生互补链的DNA或RNA核苻酸序列.目标序列targetsequence拟通过HR技术进行定性或定负检测的特定核酸/列区域.3.69Mprimer具有特定芹列的人工合成寡核甘酸片段,可与目标序列区域上下谢可扑，从而形成检定的氢键连接.促进DNA娘合唧的结合和DNA鞋的延伸“3.7蛇隙针fluorescentprobe根据特定域因序列设计的标记有荧光菸团和泮灭翦用的人工合成分核音酸片段,与互补序列退火杂交后.通过PCR旷增陆促反应择放荧光信号.用于检测样本中是否含仃特定基因序列.3.8SHtdenaturationPCR反应体系中.利用岛源条件破坏核酸二级结构中的城键,使DNA，RNA均从复杂品级结构转变为妓性单槌核甘底的过程.3.9S5annealingPCR反应体系中,需通过降低反应体系温度,使两条线性单铳核首酸通过互补Wl基间的双谴形成同郃双集的过程.3.10SIextensionPeR反应体系中，引物与模板发生退火后,在耐热Dw聚合前作用F,根据模板DNA的破葩顺序，以单个核甘陵为原料，白引物5'缆向3'端逐个添加核仃酸合成两条互补链的过程。3.11DNA*WMDNApolywrase以DNA单燧为模板、JNTP为原料，催化脱氧核仃酸加到货物或DNAsI的3'-OH端，合成互补DNA新糙所得的酣.3.12反转录的reversetranscriptase以RNA为极板指导JNTR合成”:补DNA的聚合称3.13插入insertionDNA或RNA的一种突变出式，在原有核仔酸序列中插入了一个或多个额外核甘酸，3.14缺失deletionDNA或RNA的种突变形式，在原有核件酸序列中丢失了个或多个原有核件酸.3.15抑制物inhibitor/干扰物interferentPCR检测反应体系中抑制或干扰PCR反应进行的物质，可导致PCR产物产业减少或非特界性产物增多.Ccntanimticn由于样本交叉污染或试剂、标准品、质控品、扩增产物污染等原因,导致PCR扩增体系中混入来自待检样本以外的模板，使PCR桧测出现以阳性结果的情况。3.17<gcleIhreEiIQId(Covalue实时荧光PCR扩增过程中，荧光信号强度由本底水平达到所设定荧光冏值限时所对应的循环次数，即循环阈值，其数值大小与模板核酸片段的起始拷贝数成反比。3.18WjStranspat样本由采样地点运送到悔测地点的过隹，分为内部转运(例如检测机构内部使用人工或气动传输装置等进行送样)和外部转运(例如检测机构间使用汽车、火车、飞机等交通工具进行送样4下列缩珞沿适用于本标准，CDNA互补DNA(O>mplememaryDNA)crt>NA游离DNA(CeiIfeDNA)Ct衢环阑曲(cyclethresholdvalue)ciDNA循环肿瘤DNA(CirCUlatingtumorDNA)DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)DNaw脱轧核糖核酸酸(deoxyribonuclease)dNTP脱氧核件三磷酸(dcoxyribonucleosidcIriphosphaic)d,DNA¾DNA(doublc-strandcdDNA)EDTA乙：胺四乙酸(elhyIenediaminaeiraaceticacid)FFPE福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixedDaraffin-e三bedded)miRNA微小RNA<microRNA)mRNAf5IilfRNzVniessagerRNA)PCR聚合随反应(polymerasechainreaction)RNA核犍核酸(ribonucleicacid)RNaw核糖核酸唧(ribonuclease)RT-PCR反转录聚合脚锥反应(reve11ietranscriptionPolymeraSechainreaction>so,标准操作程序(standardoperatingprocedure)SSDNA而集DNA(SingIoStrandedDNA)real(i11)ePCR实时荧光聚合演SI反应(real"inefluorescencepolymerasechainreaction)rRNA核检体RNA(ribow>malRNA)Tm熔解温度(meltingtemperature)UDG尿啼噪-DXA糖地水解醉(UraCiI-DNA8Iycosylas)5样本果集和史理5.1 总体要求应正确进行样本采集、转运、处理和保存.发生在分析前阶段的操作不当可能会破坏样本完整性.导致核酸降斛，引入污染或干扰物，Ai终影响目标序列定性或定域检测结果的准确性，实验空应就各环节制定详细的技术要求，并向样本采集、转运、接收、检测人员分别提供相应培训.1.1.1.1 实验室在开展实时荧光PCR技术极务时.除常规遵循体外诊断样本采集要求外,还可参照WST661、脚/T348、US/T640进行，应结合不同检测项目对样本的要求，并参考所使用试剂及耗材的说明，制定详细的样木采集程序，包括采样时效、采样部位、样本类型、采样装置与采集容器、采集方法、果样量、质房评价注意事项，并对采样人员提供相应培训与指导.1.1.1.2 采样人员在采集样本的应核对受检者身份、采样部位、样本类型、采样装置与采集容涔.采集完成的样本应予唯一性标识。1.1.1.3 如需受检者自行制取样本（例如痰液、尿液），应指导其如何正确制取并送检，避免因操作不当造成样本质圻不合格、检测结果不准确.5.2.2 *料5.2.2.1 采样时应参考检测r更目要求、疾病特性、病原微生物感染部位或培染细胞类型等因素，选杼采样部位与样本类型，以确保所采集样本中含有悔测目标序列，5.2.2.2 实时荧光PCR技术可检测的临床样本类型包括组织（新鲜组织、石蜡切片祖织）、细胞及其培养产物、EDTA或枸榜酸抗凝全血、干血斑、血清、血发、外周向单个核细胞、骨髓、其他体液（例如脑带液、浆膑腔积液、尿液、房水等）、产前诊断样本（绒毛膜、绒毛膜培养细,胞、羊水、羊水培养细胞等）、拭子（采集分泌物、脱落细胞、微生物等）、分泌物（痰液、脓液、唾液等）.体腔与体表冲洗液（含脱落细胞、CfDNA）、炎使、含微生物的临床样本或微生物培养样本，等.5.2.35.2.3.1 应结合不同检测Il的与疾病特点，明确样本采集的时效性，避免因在疾病发生发展过程中样本采集过早或过咫而导致假阴性结果,好染性疾病可考虑在病程不同阶段连续采样送检5.2.3.2 F术、输血、药物治疗等医疗行为可影响实时荧光PCR检测结果，采样前应明确患并有无接受上述诊疗行为，如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况.5.2.3.3 采样完成后应标明或记录具体采样时制以供回潮,5.2.4 河染*推5.2.41采样过程中应注意避免外源性核酸污柒.5.2.4.2病原微生物检测采样时迸守无菌操作.避免样本被环境微生物和定植微生物污染.5.2.5采样装量和采IM5.2.5.1 应为无菌、无DNagRNa«、次性.所用材质与所含添加物不可抑制或干扰PCR检测过程.5.2.5.2 全面和阳秘样本抗凝首选EDTA与拘栈酸盐，不可使用肝素。如何时采集多管样本，应根据采集容器添加物类型及对PCR反应有无影响制定填装顺序，其中,真空采血管采集顺序可参照WS"661执行.5.3样本运5 .X1应结合不同样本类型与检测Il标核酸特性，参考试剂盒说明也要求，制定样本转运与保存过程中的时间、温湿度条件及生物安全要求。6 .3.2样本经我集后，应尽可能减少运送环节、缩的游运时间，在规定时间内运达实验室.5.45.4.1 应结合不同检测项目制定各自详尽的样木接收，拒收标准及不合格样木退收流程.5.4.2 对经评估质量合格的样本应收尽收，样本质献评估应充分考虑样本运送时间和条件，不同类型样本的质出评价标准包含以下方面：a）全血样本：EDTA或构株酸抗凝、样本质适宜、£用容器、无凝血或溶血：b）血浆（滴样本：样本量适宜、专用容器：c）其他体液：样本愤适宜、专用容器、无污会物：d）拭子：5用拭子、保存液和容器：O组织：样本属适宜、专用容器、保存液.5.4.3 己接收样本应在规定时间内录入实验室信息系统,做好接收登记，便于临床实时查询和追踪样本状态.5.4.4 徉本拒收当样本经评估不符合接收质量评价标准，例如：标记信息错误或不足、样本类型和申请检测项目不符、抗凝方式不当、采集容渊不符合专业规范、破损或产重污染、样本处理或转运不当、样本量不满足检测最低要求，实脸室可拒收样本并做好相应记录，同时尽快通知样本聚集部门，向其解律拒收原因并建议重新采集合格样本，5.4.5 让步检f5.4 5.1特殊情况下如必须进行检测,实验室就样本可抢救程度及检测可行性进行评估后，应就样本可能存在的检测影响因素充分告知临床医师，羟沟通许可后行让步检验并将具体情况详细记录在案，同时在检测报告中箸注样本特殊情况，5.5 5.2叼询"在以卜情况的样本不宜进一步行PCR检测：肝泰抗凝血样、无标识/标记福误的样本。溶血及经冰融的全血样本不宜用于CtDNA检测.5.65.6.1 总体要求实施实时荧光PCR依测前，可采用经有效蛤证的技术方法从各类型样本中提取和纯化核酸，制釜成扩增帙板，提取与纯化操作可令核酸物颐作放、提高目标核酸浓度、去除PCR抑制物、提高PCR扩增成功率和可重复性，有利于检测标准化，5.6.25.6.21 总体要求应根据样本类型、目标核酸来源.疾病特点、检测目的,选取适宜的样本前处理方式.5.6.22 K6对样本中特殊来源或植定性差、含收低、易降解的核酸片段（例如RNA、CtDNA）.应及时而心分离相应检测成分，全血样木可经离心后分离血清、血浆、外周血单核细胤，其他体液样本可经而心后分离上潦沉渣.5.6.23 Jft匀抗子、导管等样本可经振荡.使粘附于其表面的细胞'菌体、病毒洗脱入样本保存液.5.6.24 4均It化当细胞、曲体、病毒被袤摸或粘附在其它物质内时，可通过均质化使其择故。例如：极液样本宜先消化锋放曲体；粪便样本宜机械混匀：组织样本直典碎研磨,&5.Z5流岬富集对检测目标序列含量较低的样本,应通过适亢技术手段进行分离以实现浓缩和富集,提商检测灵敏度.例如：炎使、尿液、脑汗液和其他体液样本中的细胞可经离心分离：血液及其他体液样本中的特定细胞亚群可经流式细胞荧光分选、横珠捕茯等方法分忘：组织样本中的特定类型细胞可钱激光痛票显激WSIJ获取.5.5.3OSM5.5.3.1 新鲜组织样本可采用均质器打匀、钢珠打磨、液氮研磨等方法对样本进行均质化,可以蛋白除K消化处理.5.5.3.2 化没有新鲜或冷冻组织样本的情况下,可使用中性福尔3林固定石蜡包埋组堀(fbrmalin-fixcdParatTinYmbCddCd.FFPE1样本.FFPE组织切片用于核酸提取前，应羟过脱蜡、乙醉漂洗、风干、蛋白陶K消化处理。5.5.4EIJR与纯化5.5.41MIMI*应根据样本类型、目标核酸类型(DNA/RNA)选择核酸提取与触化方法。首要版则为确保核酸结构完整收，其次为去除其他干扰勒.采取相应处理方法保证核酸的提取质量和产量,以检保满足下游检测要求,实脸室应针时实时荧光PCR检测项目翌求制定并遵照核酸提取与纯化SOP,我用商品化核酸提取试剂盒前，应对其核酸提取效率进行评估，包括核酸纯度、提取产率、完整性.&&42DN10R应根据组织、血液、拭子、尿液、粪便等不同样本类型及检测目的选择适宜提取方法.目前临床常用秋珠分离纯化法，该法裔效且易实现自动化，适宜在样本出大的情况下使用。&&43RNAm应根据目标RNA类型(总RNA.mRXA.miRNA),下讷检测所儒模板纯度、处理样本耗时和成本、以及RNA完整度要求进行选择.RNA提取过程中应做好环境消毒、操作者臼身防护、涔材预处理，注意避免RNaSC污染,以免RNA降解.主要方法包括：柱提法和磁珠分离法.5.6.5的，5.5.5.1甲苫化位点，甲基化检测需以亚硫酸级盐处理基因组I三.所有未发生甲基化的胞吃哄转化为尿嗡噬.而甲基化胞足保持不变.再利用针对甲基化和非甲基化序列的引物进行实时黄光PCR检测.影响转化的主要因素包括亚硫酸乳盐浓度、反应温位'PH值及反应时间，应严格控制反应条件，以保证转化效率.5l5l5c2RNAfiWitRNA需以OIig(XdT)或随机引物经反转录成为CDNA,再进行后续实时荧光PCR悔测，5.5.604皿评价羟上述样本处埋后获得的扩增核酸模板提取产量、纯度和完整度应符合后续检测要求，以满足犷增有效性和结果准确性.具体评价指标及判断标准、方法及操作步骤可参考GB/T37874、GB/T10<)74.如不符合相应要求,应分析原因后夷新采集样本,或对样本重新进行抽提.5.65.6.1mw*三1.1.1.1 核酸提取纯化所需样本量外，实险室应尽力保留和妥善保存残余样本，以便追溯和犯检，1.1.1.2 实验富应结合不同样本类型与目标核酸特性明馅原始样本保存条件与期限，就不同保存条件进行验证，并避免样本反复冻融以备需要时熨检，1.1.1.3 为避免RNA表达水平变化与降解，用于RNA检测的血液样本应H接抽取到含有RNA初定添加剂的果!hl管中保存，组织样本立即放入含彳FRNA稳定剂的保存管中或直接放入液凝中快速冷冻保存，5.42Rm的保存5.6.2.1 经提取纯化后的核酸模板应以适力条件保存，以尽可能减少核酸降解。5.6.2.2 保存容器材J贞应避免吸附核酸，或诱导核酸结构变化，保存痕量核酸祥本时，宜选择低吸附性材料以防核酸损失.5.6.2.3 保存体系以及温度条件应根据核酸帙板类型以及保存期限进行选界拟长期保存可参考：a) DNA:过于Tris-EDTA缓冲液，保存于0C以下：b) RNA:置于乙酹缓冲液，保存于70C以下或液氯：C)cfDNA:置于TE缓冲液,保存于20C及以下.5.6.2.4用于保存核酸样本的制冷设备不应比用自动化栉功能，以免温度反红波动致核酸降解、样本变质。5.6.3保存样本的取用5.6.3.1 枚洌斤残余样本的保存周期应参照国家或地方相关法律法规，当无文件可参照时，梗与哈床协商制定5.6.3.2 对检测结果有疑问、争议或投诉时，可取用保存样本进行奥检并记录。6槌&SmS6.1.1 总体BM实时荧光PCR扩增体系包括引物、荧光化学物质(染料或探针)、DNA聚合梅、dNTP、模板、Mg3及反应缓冲液等成分.引物和探针的设计是影响该技术的关犍因素,其决定了检测准确性和特异性：合适的DNA期合筋对扩增反应的成功至关地要：dNTP的防盘与浓度影响扩增效率：Mg是DNA聚合解发挥活性必需的辅助因子。6.1.2 引,引物宜针对模板序列保守区域进行设计，应同时考虑长度、结构、GC含地、T值等因素，使正向引物与探针距离近且不理会、技增产物片段大小适中以获得高特异性与高扩增效率,引物本身及引物之间不应存在互补序列，6.1.3 光化学制B实时荧光PCR技术使用的荧光物质主要分为荧光探针和荧光染料，前者特异性较诲，后者则会导致非特异性结果。目前临床中以荧光探计最为常用，其具有高特异性、高信喙比等优势，可用于多重PCR反应。荧光探针设计应考虑长度、GC含量、Tm值等因泰，现有探针类型包括：水解探针、分子信标、双杂交探针等.A1.4编定DNAflEMI实时荧光PCR技术常采用热稳定DNA聚合的,宜根据热稳定性、延伸速率、保真性等性能参数要求进行选择.其中T叫他最为常用，具有良好的持续合成能力和高效的廷伸速率：11hlfe耐热性高，装具反转录活性,可实现在同管中进行逆转录和扩增.对具特殊要求的该技术检冽项目，还可选择其他类型聚合醉，例如：反转录陶、热启动聚合都、高保其聚合的等。&1.5dNTP实时荧光PeR体系中包含dATP、dCTIdGTP和diTP四种扩增原料，其浓度应为50moll.-200mol1.,浓度过低会降低PCR产物的信，浓度过高则易与Mr?结合，影响演活性，四种dNTP应等球，6.1.6 M«实时荧光PCR仅需做量模板，样本来源的其他物旗可能会抑制PCR反应。为减少对PCR反庖的影响，应考虑模板的爆适加入此。8.6. Xl定性检测项目,每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控品.8.6.2.2 定房检冽J目，每次实会应设置阴性、的阳性和阳性质控品，8.6.2.3 如为基因突变、基因多态性或基因型检测，则应包括最能反映检刈情况的突变或基因里样本，短批怆测的质控至少应有一种基因突变或基因型。宜设置某一时间周期，令周期内各批次检泅所设置质控品繇测位点合计可置盅该检测项目所包含的所有位点.8.6.2.4 扩增反应的质量控制至少涵j提取的核酸模板厕量、反应体系（|»浓度与活性、离子活度、升降潮控制等）、阴性和阳性（特别是临界的阳性）对照i殳置等方面.8.6.2.5 对于定量测定，除阳、阳性顺控符合要求外,还应考虑每次实验的扩增效率（斜率、裁距、相关系数）符合规定。a5.4质拄结果新读8.5.4.1实舲室应建立防用控制程序以保证检测结果的稳定性和可克性.8.5.4.2当违反质控规则，F1.检测结果可能存在明显错识时，应拒绝接受结果，在纠正并粉证性能合格后重新检测受检并样本。8.5.43发现失控后，应时愫作、试剂、仪器、人仇、污染等环节iS行全过程分析，鱼找失控原因。失控实蛤室还应评估最后一次成功桢控活动之后受检者样本的检测结果。&5.5a5.5.1实脸室应定期评审质控数据，以发现可能提示检测系统同他的检窝性能变化趋势。8.5.5.2 发现此类造势时应采取预防措施并记录.8.5.5.3 宜尽量采用统计学和非统计学过程控制技术连续点刈验对系统的性能，通常绘制克内质控图,每JJ或间隔特定周期对室内质控进行总结和记录.8.6实”同比对&&1总体宴求8.«.1.1实验室应参加实验室间比对计划（例如：外部质员评价计划或能力验证计划,监控实验室间比对计划的结果,以保证实验室间检测结果的可比性.8.6.1.2 当不符合预定的评价标准时.实验空应实施纠正措随.8.6.1.3 室间质量结果评价可参考WS/T414执行，a6.1.4与无实验室间比对计划可利用时,实验室应采取其他方案并提供客观证据确定检测结果的可接受性.8.6.1.5 匚士参加实脸室间比对的程序，该程序包括职责规定、参加说明,以及任何不同于实验室间比对计划的评价标准.8.6.1.6 次臆室选择的实验室间比对计划应尽It提供贴近临床实际的、模拟受检者样本的比对试验.尽可能覆盖包括分析前和分析后程序的全部检测过程，8.6.2ft方案a6.2.1当无实验室间比对计划可利用时，实验室可寻找其他有相关检测资质的实验室，按照上述方法定期进行实脸室间比对，堤年不宜少于2次；或采取其他方案并提供客观证据确定检测结果的可接受性，这些方案应尽可能使用适宜的物质,&&2.2适宜物Jffi包括r有证标准物质/标准样本；以前检测过的样本：细胞库或加织库中的物项；与其他实验室的交换样本：实5金室间比对计划中日常测试的质控品.&&3检果的可比性863.1当实5金室所开展检测项目就检验程序、设备、地点、人员中1情况存在不同时,应规定比较程序和所用设备及方法，并建立临床适宜区间内受检者样本结果UJ比性的方法。8.9.3.2实脸室应对比较的结果进行整理、记录，适当时,迅速采取纠正指髓。应对发现的问题或不足采取纠正措施并保存所实施措施的记录.9期I则读和报告1.1 «*»«1.1.1 判读结果信应先IS行下列情况的样本扩增曲税形态，并根据项目SOP议定各荧光信号通道判证阈值，a）杳看标准品扩增曲城是否正常，曲线参数是否在试剂说明推荐范囹内。b）宜百阳性侦控晶扩增曲戏是否正行，Cl值是否在试剂说明推荐莅国内.C）如设置有内对照,查看其扩增曲线是否正常.Ct便是否在试剂说明推荐范纲内,以确保核酸提取的有效性.d）查存阴性质控品扩增曲线是否正常.仅在其未见明显扩增且阴阳性质控检测结果均满足实险室要求时，才可判读并发布该批次检测结果报告.1.1.2 定性项口依据试剂盒声明的判断标准进行结果判读；定量检测项目根据分析测量范困下限和上限报告定量检测结果,当结果超出分析测量范用时宜宜接报告超出上限.鉴于PCR对稀择误差的指数级放大效应，不宜进行样本柿修检测。1.2 可取票的判读与处理1.2.1 出现可疑结果时应进行复核。1.2.2 结果复核应充分考虑分析前和分析中各因素的影响.必要时可通过多次、影部位采样降低样本果集对结果的影响.也可换用其他检测试剂进行复核.1.2.3 如检测结果怀疑样本中存在有抑制物，应考虑进行稀驿验证，本稀忤仃，检测到的信勺持续变强.提示有抑制物存在.褥注意样本稀科后核酸模板同时被稀料应确保稀择过程中核酸模板浓度仍保持在具有临床检测遨义的范阚之内1.3 检满方法局厦性1.3.1 悔测报告中宜对检测方法的局限进行充分说明.1.3.2 基于已知序列信息的分型方法可能检测不到新的等位基因.说拧无法与已知等位基因和区别，为避免漏检新的等位基因，可采用多种引物组合,以提高检测到新等位基因的可能性.1.4 飨果报告答本要*1.4.1 内容应科学、规范和准确.实验室宜与检挑申请者共同商定检测报告的格式与内容.1.4.2 至少包括受检者姓名和唯标识、检测方法、报告项目中文和/或英文名称、计疑单位（应尽可能使用SI单位人样本采集日期和时间、实验室接收样本的时间、报告发布日期和时间、检测者和报告者姓名和实验室信息。1.5 结果拒告的程序1.5.1 实脸室应制定结果报告程序以礴保抽测结果准确及时地发送至检测申请者或授权可接受检测报钟的人员。1.5.2 当枪潴结果果用多种方式发送（例如*电话、邮件等）,应对每种报告方式设置训嘀现:定，避免受检者隐私殳到侵犯。1.5.3 结果报告程序应符令相应法律法规和卫生行政主管部门的要求.1.6 ttmMW1.6.1 检测报告单宜提供结果解择,帮助报告接收者正确解读检测报告.1.6.2 宜包括对检测报告单中所呈现内容的解读，如报告中出现的专业性术语、定义或计量单位.1.6.3 可对依测方法学性能、临床性能、干扰因素以及方法学局限性进行说明，1.6.4 可就后续检5金提供参考性建议.10 3注.蚯10.1 实物室应在卫生行政主管部门进行生物安全备案.10.2 实验室所属机构应成立生物安全委员会，建立生物安全管理体系.实髓室应落实实时荧光PCR检测工作开展过程中的生物安全风险评估、负责工作人员健康监测、组织生物安全培训与考核、赛杼定期报告等工作制度.10.3 实验室应时实时荧光PCR检测活动中涉及的致病性生物因丁、涉及致病性生物因子的检测活动、停染性废弃物处置过程中的风险、从事株脸工作人员的健康状况和安全知识水平、实脸室设备和应急处理措施进行风险评估，并依据风险评估结论采取相应的风险控制措施10.4 实验室生物安全管理UJ参考S233以及相应法律法规，1111.1 在疾病的临床诊疗工作中，实时英光PCR技术可针对人体组织、血液、其他体液等样本中所含有的人源性及病除金生物核酸序列，就特定核酸片段、单核甘酸多态性、小片段缺失/插入、基因融合、甲基化修饰等基因片段信息进行定性及定量检测.从核酸序列、更制、转录等水平对其进行分析.11.2 当临床诊疗决策所涉及分子片段变异信息明确时.宜采用实时荧光PCR技术检测：当分子片段信思尚不明确或变异度较大时,宜采用测序技术依测，财经测序获得的分子片段信息，可枭用实时荧光PCR技术进行验证.11.3 经实时荧光PCR松测荻得的班因片段信息，可用于感染性疾病、肿瘤性疾病、先天性及遗传性疾病及个体化用药、移植鼠型等，指V疾病的徐育、诊断、分期、分里、用药、疗效评价、耐药监测及预后评估等，详见本标准附录BW«A借用奥极光Pal技术方法A.1实时15光定ItPa我术A. 1.1实时要光定置PaI技术假光探针法)%于荧光探针的实时荧光定IikPCR技术目前在临床广泛被使用，该技术在反应体系中加入了一段灵光标记的特养性翳核计酸探针，探针的5'和3'端分别标记有报告荧光晚团(Reporter,R)和淳灭荧光基团(QuencherQ)。探针完整时R法团所发射的荧光能M被Q姑团吸收，不发出荧光.探针与模板特异性结合后，在廷伸阶段,T叫l三聚合酷的5,-3'核酸外切的活性会将探针5'邮连接的报告荧光基团水好.报告荧光基团和淬灭觉光基团分离，从而发出荧光,检测到的荧光强度与PCR产物应成正比.从而可推算出口的片段的起始量.实时荧光定量PCR技术扩增后无需开管操作,可降低污染风险.此外，实时黄光定址PCR技术还具有特异性高、定Ift准确、实验耗时短、兼容性好等优势,已被广泛应用于临床工作中.乐1.2实时J5光定PC嫉术快光M法)该技术在反应体系中加入荧光染料，荧光染料不与SSDNA链结合，且在游离状态下不发出荧光“染料fifi扩增反应的延伸循环掺入dsDNR,与小沟结合后发出荧光，荧光信号强度与产物的数届呈正相关.美光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，目前应用G广泛的央料是SYBRGreenk尽管荧光染料法的特异性低于探针法，但由于其成本更低，易于普及应用。A.1.3多1观PCR技术多重荧光PCR技术指在同一个PCR反应体系中，使用多对引物/探针，对多种目标序列同时进行扩增的方法，多，RPCR技术既兼有单反应PCR的裔特界性和灵股度，r司时具有海效和经济的特戊，可同时检测多种目标序列，例如多种耐药很因、多种病原体堪因，尤其适用于珍贝样本.然而多由荧光PCR技术对反应体系的平衡有更高要求，例如荧光标记间、多对引物及探针间的相互干扰,宜不断进行优化，以犍少存在多种制标时可能出现的扩增偏好性.1.4扩增IBi突变系统PCR技术IamplifkiitionrefractorymutationsystemPC'R.ARMSPCR>扩增阻滞突变系统PCR技术亦称等位基因特异性PCR,用于对已知灾变茶因进行检测，该技术设计有两个5'端引物，一个与野生型互补，一个与突变型互补。对于纯合性突变，分别加入两种5'然用物及3,戏引物进行平行PCR,只有与突变完全互补的引物才可延伸并得到扩增产物，如错配位于引物的3端则徐致延伸反应无法迸行，ARMSPCR法依测灵粒度裔，可检测肿胸细胞中突变比例为隔认至更低的突变艇因。A.1.5高分解率博集曲收技术(highresolutionmdlin,IIKM)高分辨率熔解的税技术是种基于实时荧光PCR的新方法，可用于检测基因突变、基因分型、单核甘酸多态性以及甲基化修饰等,该方法在反应体系中加入了新型饱和染料.通过实时监测升温过程中荧光染料与扩增产物的结合情况，根据不同熔解曲戏形状和位豌来判断是否存在基因突变或SNP,A.2英健基于实时荧光PCR技术的原理,目前还衍生有多种其他类型技术。而于RNA样本，可采用反转录实时荧元PCR,通过反转录的将RNA反转录为CDNA1再进行后续扩增。临床上，反转录案合酹链反应(revenwtranscriptionpolymerasechainrcaction.R-K'R>技术通'常,川于RNA病停检测(例如丙型肝炎病毒、人免法缺陷病有等)以及疾精相关mRNA游录产物的分析(例如非隹奇金淋巴凝、白血病和肉痛等伴随的基因易位等)，此外，甲基化特异性PCR技术(mehyla(ionspecificPCR.MSP)也在临床疾病诊治中有相关应用.同时.的若技术的不断发展.新一代实时荧光PCR技术例如数字PCR技术(digitaiPCR1dPCR)、做流控PCR技术、PCR技术阵列芯片等发展迅速，但在临床应用上仍处于探索阶段，附录B实时蚪PCR技术床建用也I1.1 映相券（中的应用1.1.1 总体M则B. 1.1.1实时荧光PeR技术可宜接检测痫原微生物特异性核酸序列,以此判阍样本中是否含有可疑病原微生物，具灵枇、特异、简便、快隆的优势，布利于疾病的早期快速诊断，8.1.1.2 该技术除用于提供病原学感染的实验室证据外，还可用于病原微生物定母、分型,耐药荔因、基因突变等检测，为蛤床诊疗决策、流行病学监测、院感防控等提供指导.8.1.1.3 在感染性疾病应用过程中应做好鉴别现症感染、既往喜染：污染、定植、条件致病菌等情况.并结合其他检测结果及临床实际，为就原学确没提供分子依据。B.1.2««»«««B.1.2.1实时荧光PCR技术可检测病毒特异性核酸序列.以明确样本中是否含有相关病毒.多里实时焚光PCR技术可同步榕测多种新毒，提高呼吸遒、消化遒等呼染院候群的诊断效率.8. 1.2.2结合特定定世标准品参考体系，实时荧光PCR检测结果可用于评价样本中的病毒含电.在临床诊疗中可用于临床病情评估、治疗决策、疗效评价、耐药监测与签定等。8.1 J3因a座定实时荧光PQt技术可针对病毒特异性基因的高度可变区,