GB_T21037-2024饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的测定.docx

ICS65.120CCSB46中华人民共和家标准GB/T210372024代替GB/T210372007饲料中二甲氧芾氨喑喔、三甲氧茶氨嘴喔和二甲氧甲基芾氨喑咤的测定Determinationofdiaveridine,trimethoprimandormetopriminfeeds2024-03-15发布2024-10-01实施国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会本文件按照GBT1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替GB/T210372007饲料中三甲氧苫胺嚅噬的测定高效液相色谱法，与GB/T210372007相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a）增加了二甲氧芾氨嗑咤和二甲氧甲基节氨嗑咤的测定方法（见第1章）；b）适用范围中增加了精料补充料和动物源性饲料原料（见第1章）；c）更改了检出限和定量限（见第1章，2007年版的第1章）；d）增加了液相色谱-申联质谱法（见第4章）；e）更改了原理（见5.1,2007年版的第3章）；）更改了试验步骤（见5.5,2007年版的第7章）；g）更改了精密度（见5.7,2007年版的第9章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。本文件起草单位：四川威尔检测技术股份有限公司、山东省畜产品质量安全中心、通威农业发展有限公司。本文件主要起草人：张凤秤、王鑫、李俊玲、唐华英、孙延军、杜雪莉、杨发树、张璐。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：2007年首次发布为GB/T210372007;一一本次为第一次修订。饲料中二甲氧苇氨喀口定、三甲氧苇氨喀口定和二甲氧甲基玉氨喀咤的测定1范围本文件描述了饲料中二甲氧羊氨喀呢、三甲氧革效腐呢和二甲氧甲基羊氨喀咤的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。本文件适用于配合饲料，农缩饲料，精料补充料、添加剂预混合饲料和动物源性饲料原料中二甲氧茶氨啼唬、三甲氧苇氨喀嚏和二甲氧甲基羊经嗑I淀的测定。本文件液相色谱串联质谱法的检出限为2.5ugkg,定量限为5.0gRg:高效液相色谱法的检出限为0.25mgkg定量限为0.50mgkgo2规范性引用文件下列文年中高内容通过于的规范神用做我改祭假件必和可水的条款代中，日胞的引用文件，仅该目用对的版本适与本义理，不注的部引用复的其最而级本（包据所窗的随改）适用于本文件。GB/T6682分析实验至用水规格和试验分法GB/T20195动物饲料武样的时备3术语和定要本文件没有需要界定的术语和定义。4液相色谱一串联质谱法（仲裁法）4.1 原理试样中的待测物在弱碱性条件下用乙酸乙酯提取、正己烷脱脂，混合型强阳离子交换小柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4.2 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1 水：GB/T6682,一级。4.2.2甲醇：色谱纯。4.2.3乙睛：色谱纯。4.2.4甲酸：色谱纯。4.2.5乙酸铉:色谱纯。4.2.6氨水。4.2.7乙酸乙酯。1.1.1 乙酸钠溶液(82g1.):称取8.2g乙酸钠，用水溶解，转移至100m1.容量瓶中，定容，混匀。4.2.9 5%乙酸溶液：移取5ml.冰乙酸于100m1.容量瓶中，用水稀释、定容，混匀。4.2.10 现乙酸-乙胎溶液：移取Im1.冰乙酸于100m1.容量瓶中，用乙脂(4.2.3)稀释、定容，混匀。4.2.11 乙月青-5%乙酸溶液：移取IOm1.乙界K4.2.3)于100m1.容量瓶中，用5%乙酸溶液(4.2.9)稀释、定容，混匀。4.2.12 2.12正己烷乙脂饱和溶液：量取80m1.正己烷于100m1.分液漏斗中，加入IOm1.乙脂(4.2.3)后，剧烈振摇5min,静置分层后，弃去乙胞层。4.2.13 8%氨水-甲醇溶液：量取50m1.甲醇(4.2.2)于100m1.容量瓶中，再加入8m1.氨水(4.2.6),用甲蝌释、定容，混匀。4.2.14 0.2%甲酸溶液：量取500m1.,水于100Om1.,容量瓶中，加入2m1.甲酸(4.2.4),用水稀释、定容，昆匀。4.2.15 乙酸较-0.2%甲酸溶液:称取0.154g乙酸馁(4.2.5),用0.2%甲酸溶液(4.2.14)溶解，转移至1000ml,容量瓶，定容，混匀。4.2.16 复溶液：移取150ml.乙月青(4.2.3)于100om1.容量瓶中，用乙酸筱-0.2%甲酸溶液(4.2.15)定容，昆匀。4.2.17 2.17标准储备溶液(Imgm1.):称取二甲氧茉氨嗓咤(CAS:5355-16-8,纯度不低于98%)、三甲氧羊氨嘘喔(CAS:738-70-5,纯度不低于98%)和二甲氧甲基苇氨嗑呢(CAS:6981-18-6,纯度不低于98%)标准品各Iomg(精确至0.01mg),分别置于IOm1.容量瓶中，用现乙酸-乙月青溶液(4.2.10)溶解、定容，混匀。T8°C以下贮存，有效期6个月。4.2.18 混合标准中间溶液I(IOugm1.):分别准确移取二甲氧茉氨嗑噬、三甲氧羊氨嗑唆和二甲氧甲基羊氨嗑喔标准储备溶液(4.2.17)各Im1.于100m1.容量瓶中，用现乙酸-乙脂溶液(4.2.10)稀释、定容，混匀。T8C以下贮存，有效期3个月。4.2.19 2.19混合标准中间溶液Il(IHgm1.):准确移取Im1.混合标准中问溶液1(4.2.18)于IOm1.容量瓶中，用康乙酸乙月青溶液(4.2.10)稀释、定容，混匀。临用现配。4.2.20 2.20内标标准储备溶液(Imgm1.):称取d2三甲氧羊氨嚏噬(CAS:1189460-62-5,纯度不低于98%)标准品10mg(精确至0.0Img)于10ml.容量瓶中，用1%乙酸-乙盾溶液(4.2.10)溶解、定容,混匀。T8C以下贮存，有效期6个月。4.2.21 内标中间溶液(IoUgm1.):准确移取Im1.内标标准储备溶液(4.2.20)于100m1.容量瓶中，用1%乙酸-乙胞溶液(4.2.10)稀释、定容，混匀。-18C以下贮存，有效期3个月。4.2.22 内标工作溶液(lgm1.);准确移取Im1.内标中间溶液(4.2.21)于IOm1.,容量瓶中，用1%乙酸乙月青溶液(4.2.10)稀释、定容，混匀。临用现配。4.2.23 混合标准系列溶液：准确移取适量体积的混合标准中间溶液II(4.2.19)及1001.l1.内标工作溶液(4.2.22)于IOm1.,容量瓶中，用复溶液(4.2.16)稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为0.5ngm1.4.2.24 ng/ml>2.0ng/m1.、10.0ngm1.>50.0ng/m1.、100.0ngml.利内标质量浓度均为IOng/m1.的混合标准系列溶液。临用现配。4.2.24 混合型强阳离子交换小柱：60mg3m1.,或性能相当者。4.2.25 微孔滤膜：0.22urn,有机系。4.3仪器设备4.3.1 液相色谱-申联质谱仪：配电喷雾离子源(ESD。4.3.2 分析天平：精度为0.Img、0.0Imgo1.1.1 3.3涡旋混合器。1.1.2 3.4冷冻离心机：转速不低于100oormin.1.1.5 超声波清洗器。1.1.6 固相萃取装置。1.1.7 氮吹仪。4.4 样品按照GB/T20195规定制备试样，至少Og.粉碎使具全部过0.425mm试验筛，混合均匀.装入密闭容器中，备用。4.5 试验步骤4.5.1 提取平行做2位武验称取试样约2g（精确至0.1mg）,置于50m1.离心管中，力入100H1.内标工作溶液（4.2.22）0m乙酸耐溶液（20和05m1.每水420）,涡旋混合2min,准确加入IOm1.乙酸乙酯（4.2.7）揭施是合2m品超应据取10面应态高据配部合1次），于4亳下oomin离心5min,移取上层有机相至另一Om6管中准确州人TO-mfcZ取乙的畿2.7）重复提取1次，合并有机相，混匀。准确移取2ml有机和，50必氮气吹条适干，加天系上乙睛-5%乙酸溶液（4.2.11）溶解残渣，最旋混合30、年加大m1.正燃院足晴他流维液（4.202,测旋混合s.4°C下10000rnn离心5min,养上P区正己烷洲级，全部下层各液,备用。注：若取液是化严重，弃人有正己液后，范乙时地而格液1复股4.5.2 W混合型强围离于交换原非依次用的甲种有乙册考端乙酸溶液：2.1活化，取备用液（4.5.1）全部过柱。秀别用3m1.乙脖-5%乙酸溶液（4.2.11）、3m1.甲醇（42.2）淋洗，抽干后加入5m1.8%氨水-甲醇容液（2.13）洗脱，收集洗脱液，50C下氮气吹至近于，准确丽入Im1.复溶液（4.2.16）,涡旋混合30过微犯滤膜（4.2.25）,滤液待测。4.5.3 测定4.5.3.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：C柱，柱长50mm,内径2.1mm,粒径1.8Pm,或性能相当者；b）柱温：350C;c）流速：0.3mlmin;d）进样量：3Ul;e）流动相：A相为乙脐（4.2.3）,B相为乙酸锭-0.2%甲酸溶液（4.2.15）,梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间minA相/%B相/%0.0015852.0015855.0030705.1010006.0010006.1015857.0015854.5.3.2 ¾缔质谱参考条件如下：a)电离方式：电喷雾电离，正离子模式(ESI*);b)检测方式：多反应监测(MRM);c)毛细管电压：4.OkV;d)离子源温度：350C;e)脱溶剂气温度：300;f)脱溶剂气流速：7Umino多反应监测(MRM)定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2。表2多反应监测(MRM)离子对、碰撞能弁考值待测物名称定性离子对m定量离子对m/z碰撞能量eV二甲氟茶氨喀咤261.2>245.0261.2>245.030261.2>123.325三甲氧苇氨喀咤291.3>230.2291.3>230.225291.3>261.030二甲氧甲基羊氨嗑噫275.4>259.3275.4>259.330275.4>123.325三甲氧节氨喑咤300.2>234.0300.2>234.O254.5.3.3 混合标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液(4.2.23)和试样溶液(4.5.2)上机测定。混合标准溶液中二甲氧不氨嗓咤、二甲氧节氨嚅咤、二甲氧甲基节氨喀咤和d,一甲氯节氨嗜咤的定量离子色谱图见附录A.4.5.34定性在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中待测物的保留时问一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子卡度>50%>20%50%>10%20%10%最大允许偏差±20%±25%±30%±50%4.5.3.5定量以标准溶液中待测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中待测组分的质量浓度和内标质量浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测组分质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。4.6 试验数据处理试样中二甲氧茶氨嗑咤、三甲氧茉氨喀咤、二甲氧甲基茉氨嗑咤含量以质量分数w,计，数值以微克每千克(JgZkg)表示。多点校准按公式计算；单点校准按公式计算：>XVtXV3X100o应.V.XwX1000式中：P由标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度，单位为纳克每亳升(ngm1.);V 1试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升(m1.);V 3净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为亳升(In1.);V 2净化用试样提取溶液体积，单位为毫升(m1.);m试样质量，单位为克(g)；1000换算系数。AX人.X.*p,XKXV；XIMow'A.×At×V1Xm×1OOO2式中：A试样溶液待测物色谱峰面积；Aw标准溶液内标物色谱峰面积；P，标准溶液待测物的质量浓度，单位为纳克每亳升(ngm1.);P，试样溶液内标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ngm1.)V 1试样提取用乙酸乙酯总体积，单位为毫升(m1.);V 3净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为亳升(m1.)；A,标准溶液待测物色谱峰面积；A,试样溶液内标物的色谱峰面积；pw标准溶液内标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ngm1.);V 2净化用试样提取溶液体积，单位为亳升(m1.);m试样质量，单位为克(g)；1000换算系数。测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。4.7 精密度在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。5高效液相色谱法5.1 原理试样中的待测物在弱碱性条件下用乙酸乙酯提取、正己烷脱脂，混合型强阳离子交换小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。5.2 试剂或材料除非另有规定，很使用分析纯试剂。5.21 水：GB/T6682,级。5.22 2甲醇：包谱纯5.23 3乙月青色谱缠，524氨水。5.24 5乙酸乙雷C5. 2.6酸的解液（82g:施取总之二乙酸的用水溶解，100ml餐量瓶中，定餐，混匀.5.2.7 用乙酸溶液：移取医承三酸于1.容作雨中，用水疏通在容，混匀。S28晚乙酸溶液：移职的冰乙酸放OmI学热瓶中，用水稀释，定容，混智。5.2.9 乙晴司乙酸溶酸移111.2.3）于m1.容策瓶中用5%乙酸容液（5.2.7）稀释、定容，混句。5.2.10 IEJ是乙睛饱和溶液，取正完60m±湖斗加入101.月青（5.2.3）,剧烈振摇，鬣置分层后，弃去容脚5.2.118%氮小甲醇溶液,量取50ml甲酸在器i1OOm1.容中，再加入ml数水（5.2.4）,用甲醇稀释、定容，混句。5.2.12磷酸氢钾香液（0.05mol1.）:准确称取6.80g磷酸二氢钾于10Om1.省量瓶中，用水溶解、定容，混匀。5.2.13标准储备溶液（Img（m1.）:称取二甲氧苇氨啼咤（CAS:53516-8,度不低于98%）、三甲氧苇氨嗑喔（CAS:738-70纯度不低下98%）、二甲氧甲基苇氨瞬膑（CAS?6981-18-6,纯度不低于98%）标准品各IOmg（精确至0.0Img）,分别置于10mE容量瓶中，用乙酸溶液2.8）溶解、定容，混匀。28贮存，有效期3个月。5.2.14混合标准中间溶液（20gm1.）:分别准确移取二甲氧羊氨喀咤、三甲氧茶氨嗑咤、二甲氧甲基苇氨喀咤标准储备溶液（5.2.13）各Im1.于50m1.容量瓶中，用战乙酸溶液2.8）稀释、定容，混匀。临用现配。5.2.15混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.2.14）于10m1.容量瓶中，用1%乙酸溶液（5.2.8）稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为0.1口g/m1.、0.2gm1.1.0gm1.2.0pg/m1.、5.0gm1.和10.0gm1.的混合标准系列溶液。临用现配。5.2.16混合型强阳离子交换小柱：60mg3m1.,或性能相当者。5.2.17微孔滤膜：0.45m,水系。5.3仪器设备5. 3.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。5.3.2 分析天平：精度为0.1mg和0.01mg。5.3.3 泯旋混合器。5.3.4冷冻离心机：转速不低于100Oor/mino1.1.5 超声波清洗器。1.1.6 固相萃取装置。1.1.7 氮吹仪。5.4 样品同4.4。5.5 a½蜘5.5.1 卿平行做2份试验。称取试样约2g(精确至0.Img),置于50ml,离心管中，加入10ml.乙酸钠溶液(5.2.6)、0.5m1.氨水(5.2.4),涡旋混合2min,准确加入Iom1.乙酸乙酯(5.2.5),涡旋混合2min,超声提取IOnlin(5min涡旋混合1次)，于4下100Oormin离心5min,上层有机相移至另一50m1.离心管中，再准确加入10m1.乙酸乙酯2.5)重复提取1次，合并有机相，混匀。准确移取10ml有机相，50C下氮气吹至近千，加入6m1.乙糖-5%乙酸溶液(5.2.9),涡旋混合30s,再加入6m1.正己烷乙牌饱和溶液2.10),涡旋混合30s,于4下100oOrmin离心5min,弃去上层正己烷溶液，取全部下层溶液，备用。注：若提取液乳化严重，弃去上层正己烷溶液后，用6m1.正己烷乙雕和溶液(5.2.10)重复脱fl旨。5.5.2混合型强阳离子交换小柱依次用3m1.甲醇(5.2.2)、3m1.乙腊-5%乙酸溶液(5.2.9)活化，准确加入3m1.备用液(5.5.1)过柱。分别用3m1.乙睛-5%乙酸溶液(5.2.9)、3m1.甲醇(5.2.2)淋洗,抽干后加入5m1.8%氨水甲醇溶液(5.2.11)洗脱，收集洗脱液，50C下氮气吹至近干，准确加人Im1.1%乙酸溶液(5.2.8),涡旋混合30s,用微孔滤膜(5.2.17)过滤，滤液待测。5.5.3 高效液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C柱，柱长250mm,内径4.6mm,粒径5m,或性能相当者b)流动相:甲醇(5.2.2)+磷酸二氢钾溶液(5.2.12)=25+75;c)柱温：30;d)流速：1.0mlmin;e)检测波长：230nm;f)进样体积：20U1.554碇5.5.4.1 混合标准系列溶液和试样溶液的渊定在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液(5.2.15)和试样溶液(5.5.2)上机测定。二甲氧节氨喀陡、三甲氧节氨哪咤和二甲氧甲基羊氨啥咤标准溶液的高效液相色谱图见附录Be5.5.4.2 定性以保留时间定性，试样溶液中二甲氧节氨嗑咤、三甲氧节氨喀咤、二甲氧甲基羊氨嘴咤保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中二甲氧羊氨喀咤、三甲氧羊氨喀咤、二甲氧甲基茉氨喘咤的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。5.5.4.3 定量以二甲氧羊氨嗑噬、三甲氧茉氨嚏噬、二甲氧甲基节氨喘噬的质量浓度为横坐标，色谱峰面积(响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用1%乙酸溶液(5.2.8)稀释后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液的质量浓度相差不超过30%。5.6试验数据处理试样中二甲氧羊氨嗒境、三甲氧苹级喀咤和二甲氧基手氨嘴咤育量以质量分数w,计，数值以亳克每千克(mgkg)表赤。多点城准按公式计算；单点校准按公或计角u.>XV,×ViXV.X100OV,×V.XmX1O(M式中：P系准曲线转到的模样链液史黄测物质黄装度，单位为散点每它量(m1.);匕样提取用乙版乙体，电GnR%/净化前复溶应述的溶玻体积，单位为亳开V ;净化、氮气医至近于后夏溶原的样溶限热积，单何为亳；V 移取上清液体预一位为童1.);V ,净化用备开浓体层，单位为级(m1.);m试样质量位力员(g)；f-稀释倍数；1000换算系数。式中：A忒样溶液的待测物色谱峰面积；V 1试机提取用乙酸乙酯总体积，单位为亳升(m1.);V 净化前复溶后状链溶液体积，单位为宅升(m1.)Vo净化、氮气嗅至近干后复部师械样游液体积，单位为施开(m1.);p.一一标准溶液中待测物的质量浓度，单位为微升(ygm1.);A、标准溶液待测物色谱峰面积；V2移取上清液体积，单位为亳升(m1.);V4净化用备用液体积，单位为亳升(m1.);m试样质量，单位为克(g)；f稀释倍数；1000换算系数。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。5.7精密度在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不超过该算术平均值的10机附录A(资料性)二甲氧卡氨喀口定、三甲氧苇氨喀口定、二甲氧甲基苇氨嘴口定和dg-三甲氧苇氨喀口定标准溶液定量离子色谱图二甲氧羊氨喀咤、三甲氧羊氨喀咤、二甲氧甲基茉氨嚅咤和d。三甲氧苇氨喀咤标准溶液的定量离子色谱图见图A.1图A.4o100-1.7S8图A.1二甲氨苇氨嘴嘎标准溶液(1ngm1.)定离子色谱图-100806040s三20-0jwI1*f111TT*III2345678i/min图A.2三甲筑苇氨嚏呢标准溶液(1ngn1.)定离子色谱图806040lj三:图A.3二甲氧甲基苇氨嗑咤标准溶液(lng11D定量离子色谱图2.056100-80-三A4dg=甲氨藻氮密®标准溶液(10IWln1.)定离子色谱图IO附录B(资料性)二甲勰苇氨嚅唳、三甲加苇氨啸咤和二甲制甲基羊氨De喔标准溶液高效液相色谱图二甲氧节氨啼咤、三甲氧羊氨嘘咤和二甲氧甲基羊氨嘘咤高效液相色谱图见图B.lo-0.5.I,II、j>j0SIO15202530351/min标引序号说明：1 二甲氧羊氨啼咤；2 三甲氧节氨喘咤；3 二甲氧甲基羊氨唏咤。图B.1二甲融苇氨嘴喔、三甲疑节氨嚅症和二甲箕甲基苇氨Ie症标准溶液(2.0gm1.)高效液相色谱图S0ZZ8IZ一9中华人民共和国国家标准饲料中二甲氧苇氨噬喔、三甲氧茉氨畸咤和二甲氧甲基茶氨噬嚏的测定GB/T210372024中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号（100O29）北京市西城区三里河北街16号（100o45）网址www.s总编室：（Olo）68533533发行中心：（010）51780238读者服务部：（HO）68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销开本880X12301/16印张1字数25千字2024年3月第一版2024年3月第一次印刷书号：1550661-75429定价31.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话：（010）68510107