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甲基化检测在妇科肿瘤中的应用2024摘要肿瘤的发生发展过程中常伴随着表观遗传学改变，DNA甲基化是最常见的表观遗传学修饰方式。甲基化事件与妇科肿瘤的早期发生密切相关，基于液体活检技术的甲基化检测方案在妇科肿瘤早筛和预后评估中取得重要进展，多种来源的微创和无创样本中甲基化检测呈现出类似或优于传统方案和策略的可靠性。本文对甲基化检测在妇科肿瘤筛查、诊断和监测的相关进展作一综述，探讨其当下和未来在妇科肿瘤诊治中的价值和研究方向。肿瘤的发生发展过程本质是体细胞变异不断累积和基因的表达失调，主要的分子事件包括基因突变、拷贝数变异、结构变异以及表观遗传学改变。表观遗传学是在不改变DNA序列的前提下对基因进行修饰，调控基因表达和发生可遗传的改变，与细胞生长、分化、凋亡及转化等生物学过程密切相关1。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，基因组CpG二核苜酸的胞嗜D定5号碳位共价键结合一个甲基基团,属于最常见的表观遗传学修饰。肿瘤的发生常伴随着原癌基因低甲基化的表达激活与抑癌基因高甲基化的表达失活。利用不同组织间甲基化表达的差异，甲基化检测已用于多种实体瘤的筛查和诊断。在全球和全国范围内，妇科肿瘤发生率逐年增长，严重影响女性的总体健康和生殖健康，是国计民生的重大威胁。早期识别和管理妇科肿瘤病变具有重大的临床和社会意义。甲基化事件与妇科肿瘤的早期发生密切相关，在宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌中均已获得大量证据。这些研究结果为甲基化检测应用于妇科肿瘤的筛查和预后评估提供了理论基础。目前在妇科肿瘤中，基于液体活检技术的甲基化检测方案在妇科肿瘤早筛和预后评估中取得重要进展，多种来源的微无创样本中甲基化检测呈现出类似或优于传统方案和策略的可靠性。本文对甲基化检测在妇科肿瘤筛查、诊断和监测的相关进展作一综述，探讨其当下和未来在妇科肿瘤诊治中的价值和研究方向。一、甲基化检测的方法学液体活检技术是一种利用人体血液、尿液、腹腔积液等中的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNAX循环游离DNA(circulatingcellfreeDNA,cfDNA外泌体等物质进行肿瘤生物学分析的技术。目前用于妇科肿瘤诊疗探索的甲基化方案基本立足于微量而准确的液体活检技术。检测方案分为位点特异性检测以及全基因组水平两类。甲基化检测需要对初始DNA样本进行预处理，包括重亚硫酸盐转化、限制性内切酶消化、基于甲基化抗体或甲基化CpG结合域亲和的富集方法等2。其中重亚硫酸盐转化是常见选择，亚硫酸氢钠可使DNA上未甲基化的胞口密碇脱氨基生成尿I®咤，而甲基化修饰过的胞口密咤无反应，通过不同方式比对定性或定量得出特定或整体基因甲基化情况。基于特定位点的甲基化检测包括甲基化特异性PCRx基于荧光的Methy1.ight测序、焦磷酸测序等。基于全基因组的甲基化检测分为基于基因芯片及高通量测序两类，测序方案包括基于高通量测序的全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(whole-genomebisulfitesequencing,WGBS)、简化基因组重亚硫酸盐甲基化测序(reducedrepresentationbisulfitesequencing,RRBS)、单分子实时测序技术(single-moleculesequencinginrealtime,SMRT基于电流信号的纳米孔测序法等。此外，甲基化检测还有基于DNA水解的高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法(liquidchromatographmassspectrometer,1.C-MS)、基于甲基化特异性抗体的(enzymelinkedimmunosorbentassay,E1.ISA)法、基于限制性内切酶及焦磷酸测序的(IUminOmetriCmethylationassay,1.UMA)法等3。这些技术的进步使临床甲基化检测更加高效和快捷。二、甲基化检测用于宫颈癌筛查和预后管理宫颈癌是全球最常见的妇科恶性肿瘤。传统的宫颈癌筛查基于宫颈脱落细胞的细胞病理学和高危HPVDNA检测及分型。随着甲基化在宫颈癌诊疗中的应用日益成熟，其应用情境越来越多。1 .甲基化检测独立用于宫颈癌筛查：甲基化检测作为宫颈癌的独立筛查方案的效能可能等同甚至高于目前的HPVDNA和/或细胞学检测。PAX1基因联合SEPT9基因甲基化用于检测宫颈癌及癌前病变的曲线下面积areaundercurve,AUC）为0.844,而PAX1基因诊断浸润癌可能优于目前的HPVDNA或细胞学检测5。甲基化产品WlDTM-qQN（DPP6、RA1.Y1.和GSX1这3种基因谱）诊断宫颈上皮内瘤变3级（cervicalintraepithelialneoplasiagrade3,CIN3）或更严重病变（CIN3+）的敏感度达78%,特异度90%,在年龄30岁的人群中诊断敏感度上升至83%,诊断宫颈癌的敏感度达100%6o结合转录组产物的甲基化分析能提高检测效能。FAM19A4基因结合miR124-2甲基化检测对宫颈癌检出率98%,包括罕见的组织类型和高危HPV阴性的宫颈癌7。这些甲基化筛查宫颈癌的结果均优于或类似目前传统筛查策略。但是甲基化单独应用也存在敏感性不如HPVDNA的缺点，毕竟HPVDNA对于宫颈病变的敏感性目前是无可替代的。在非HPV相关的宫颈癌中，甲基化也许将会发挥更大的作用。2 .甲基化联合HPVDNA检测用于宫颈癌筛查：目前总体上认为，相较于单一方案筛查,HPVDNA检测联合甲基化检测能提高筛查宫颈癌的特异度和敏感度8。这方面的证据越来越多。宫颈脱落细胞的PAX1基因和JAM3基因甲基化检测用于诊断QN3+敏感度和特异度分别为67.2%和89.6%而HPVl6/18检测诊断QN3+的敏感度和特异度为68%和66.4%,二者联合诊断QN3+的特异度可提高至96.1%9。对抑癌基因EPB411.3及HPVl6、18、31、33等CPG位点甲基化状态评分加权的筛查产品（命名为S5检测），在设定临界值为0.80时，检测CIN3和浸润癌的敏感度分别为91.18%和99.81%10oHPVDNA检测作为宫颈癌筛查首选方案的地位已经获得全球认可。在此背景下，甲基化作为HPV阳性女性的分流价值逐步被验证,其效能可能优于传统的细胞病理学11。HPV阳性女性3年累积发生QN2+的风险为6.8%,而ZNF671/ASTN1/ITGA4/RXFP3/SOX17/D1.X1基因甲基化检测阴性者3年CIN2+累积风险将降低至4.5%,二者均阴性3年累积发生QN2+的风险为2.9%12。一项随访10年的队列研究提示HPVI6+女性发生CIN3+的10年累积发病率约为25%,其中若HPVl6的CpG5602、6650、7034、7461、31和37高甲基化及E6癌蛋白阳性，累积发病率风险危险比为8.911.5倍13o3 .甲基化用于宫颈细胞学微小异常结果的管理：细胞学微小异常结果一般定义为不能明确意义的非典型鳞状细胞(atypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance,ASC-US)和低度鳞状上皮内病变(low-gradesquamousintraepitheliallesionsr1.SI1.微小异常结果发生宫颈浸润癌的风险较HSI1.更小，将导致更多的阴道镜转诊，对女性身心造成影响。对这一人群的精准分流是宫颈癌筛查的另一重要课题。在细胞学为ACS-US的患者中，CCNA1基因甲基化检测预测CIN2+具备高特异度(99.3%)14,弥补了HPV检测低特异度的缺点。前述的S5检测对于HPV(+X细胞学为ASCUS或1.SI1.的患者预测组织学<CIN2.ClN2和CIN3+的AUC值为0.6440.78015o因止匕，甲基化用于细胞学微小异常可显著降低不必要的阴道镜转诊率。4 .采用不同来源标本进行甲基化检测的效能：通过自取样装置获得的宫颈阴道细胞学样本进行甲基化分析筛查宫颈癌的效果不亚于细胞学和HPV检测16。止匕外，已有研究利用外周血cfDNA、尿液甲基化检测进行宫颈癌筛查的报道17,18,其准确性不劣于细胞学方案。5 .甲基化对于宫颈病变预后的预测价值：甲基化检测对于宫颈癌前病变的转归或进展有预测价值,可用于指导临床管理。对未经治疗CIN2/3患者，分析宫颈脱落细胞FAM19A4miR124-2基因甲基化状态，阴性者的2年内累积转归率达74.7%19。对治疗后的QN2/3患者，分析宫颈脱落细胞中JAM3基因甲基化状态，预测治疗后结局为治愈或复发的敏感度和特异度分别为94.8%和93.7%20o宫颈组织中8基因甲基化指标(DES、MA1.MTIF2xPIP5K1AxRPS6KA6xANGE1.2xMPP和PAPSS2)与宫颈癌总生存率显著相关21。另一基于甲基化检测的机器学习算法计算所得的支持向量机模型分数可用于预测宫颈癌复发，AUC值为0.83322o6 .甲基化检测在特殊人群宫颈癌筛查和管理中的应用：感染人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)人群HPV感染风险较普通人群增高。世界卫生组织推荐HIV人群筛查宫颈癌的年龄提前至25岁，筛查的频率也较普通人群更频繁23。甲基化也可用于HIV人群宫颈癌的检测、癌前病变进展及转归预测。在宫颈脱落细胞学中ASC1.K1.HX8甲基化作为HlV女性检测ClN3+的AUC值为0.790.8124HIV人群同时合并QN2/3治疗后若宫颈脱落细胞中ASc1.l基因或1.HX8基因甲基化阴性，4年内复发的风险5%25o在妊娠人群中进行癌前病变或宫颈癌的筛查和管理具有挑战。妊娠女性中传统细胞学及HPV检测转诊行阴道镜检查及活检的标准并不明确，诊断宫颈病变后切除治疗还是保守观察也存在很多争议。一项横断面研究发现FAM19A4miR124-2甲基化试验阴性几乎可排除CIN3的孕妇进展成恶性疾病的风险26,这对于保守治疗及妊娠期随访直到安全分娩至关重要。三、甲基化检测用于子宫内膜癌筛查子宫内膜癌是全球女性第6位的高发癌症，目前主要依据症状学及经阴道超声行初步筛查或分流，血清肿瘤标志物有时作为辅助诊断的方案，诊断性刮宫或宫腔镜取得组织学病理则作为金标准。然而症状学筛查的特异性低、经阴道超声评估内膜病变的内膜厚度阈值尚无统一标准，目前指南尚未推荐用于子宫内膜癌筛查的肿瘤标志物，而诊断性刮宫或宫腔镜评估均为有创操作。子宫内膜癌的早诊早筛依然存在巨大挑战。利用宫颈细胞学等无创性采样方式进行甲基化检测已经成为内膜癌筛查领域成果最丰富的研究方向。1 .宫颈细胞学方案：宫颈液基细胞学标本可以进行甲基化检测进行子宫内膜癌的诊断。BH1.HE22/CDO1/HAND2基因甲基化方案27、BH1.HE22CDO1CE1.F4甲基化方案28,诊断子宫内膜癌的敏感度和特异度达87.0%91%86.0%95.5%.HerZOg等29设计的WID-q甲基化方案靶向ZSCANl2和GYPC基因,在有出血症状的患者中诊断子宫内膜癌的敏感度和特异度分别达97%和76%,在绝经后阴道流血分组中采用阻拭子的诊断子宫内膜癌的敏感度和特异度分别达100%和89%。我国学者在绝经后女性中以宫颈细胞学CDOl和CE1.F4基因甲基化产品筛查子宫内膜癌，敏感度和特异度分别达87.5%和90.8%,联合经阴道超声可进一步改善筛查的敏感度30。这些甲基化筛诊子宫内膜癌的研究结果均优于目前传统筛查策略，但未来需要在社区人群中进一步揭示甲基化检测筛查子宫内膜癌的价值。2 .其他采样方案：采用不同来源的样本进行甲基化检测用于子宫内膜癌筛查具有相似的准确性。Sangtani等31采用卫生棉条采集细胞学样本进行HoXA9、RASSFKHTRlB基因的甲基化分析，诊断特异度达100%o如果结合这3个基因的拷贝数和突变状态，可以将诊断敏感度提高至I91.7%。VandenHelder等32采用尿液检测GHSR、SST、ZIC1基因甲基化状态，该方案诊断子宫内膜癌的AUC达0.95。通过宫腔灌洗液的方法也可以简便地获得细胞学标本进行甲基化检测33。四、甲基化检测用于上皮性卵巢癌筛查卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其起病隐匿，临床症状缺乏特异性，大多数患者发现时已是临床晚期，早期诊断仍然是改善预后的关键。目前早期卵巢癌缺乏有用的诊断标志物，临床使用的血清生物标志物糖类抗原125(carbohydrateantigen125,CA125)和经阴道超声诊断价值有限。近年来,多项研究采用液体活检技术对CtDNAsCfDNA等物质进行甲基化检测以期寻找高效的早期卵巢癌诊断标志物。相关研究已经发现，甲基化检测识别早期卵巢癌效能优于CA125341.外周血CfDNA方案：1.iang等35以1272个卵巢癌特异性差异甲基化区域为基础构建诊断模型，采用血浆作为样本进行分析，该模型区分良，性盆腔包块与卵巢癌的敏感度94.7%,特异度88.7%,在CA125检测阴性的患者中进一步识SU卵巢癌患者的AC=0.88,但识别I期卵巢癌敏感度稍降低至83%。Singh等36采用基于荧光的Methy1.ight测序分析卵巢癌和非癌样本的CfDNA中HOXA9和HIC1基因甲基化状态，任一或二者诊断卵巢癌敏感度为88.9%,AUC为0.9,对照组血清中没有观察到高甲基化的情况。但目前CfDNA甲基化检测用于卵巢癌的规模都较小，尚需大队列的进一步验证。与传统肿瘤标记物(CAI25、罗马指数等)比较的研究更少。此外，目前研究都局限于良恶性病变的鉴别，甲基化真正用于卵巢癌筛查的价值，尚待严密设计的研究证实和推广。2.其他方案：宫颈细胞学是研究者比较关注的卵巢癌检查方案。传统细胞学仅能发现20%左右的卵巢癌。Chang等37采用宫颈刮片取样分析POU4F3.MAGI2基因高甲基化状态，其用于检测卵巢癌的敏感度和特异度分别为61%和62%69%.WU等38也以宫颈脱落细胞作为样本进行甲基化检测，发现AMPD3、NRN1和TBX15基因甲基化组合似乎有更高诊断卵巢癌的效能，敏感度达81%,特异度达84%o转录组水平分子也有望作为甲基化标志物，如微小RNAmiR-145可能通过抑制甲基化事件上调抗肿瘤分子的表达39,长链非编码RNA（1.OCl34466庇81%的高级别浆液性癌中呈现高甲基化状态40o这些方案为甲基化检测用于卵巢癌检测提供新的思路和方向。五、甲基化检测在妇科肿瘤研究中的不足和研究方向甲基化检测在妇科肿瘤应用中的不足包括：（1）研究应用的靶基因各异，研究间异质性较高，尚待遴选表现优异的候选基因。（2）甲基化检测的准确性尚待进一步提高，如宫颈癌和内膜癌检测中的敏感度以及卵巢癌检测中的特异度，尚待制备工艺和检测技术的进步。（3）目前还没有基于社区人群的甲基化检测，无法产生基于一般人群的重要证据，传统筛查和检测方案的地位尚无法被甲基化取代。（4）对甲基化结果以及肿瘤患者的随访、检测不足，随访时间短、研究规模小，甲基化检测的预后价值有待进一步明确。（5）传统方案之外的甲基化检测路径（如宫颈细胞学自取样、尿液、经血等）研究较少，不足以产生高级别证据。（6）甲基化作为表观遗传的主要改变，其基础机制的表达及相关组学研究不够，如子宫内膜癌中甲基化与代谢组学之间的联系和影响，羟甲基化在妇科肿瘤中的地位和作用等,核蛋白修饰等其他表观遗传学对甲基化表达的影响等，均需要进一步深入探索。（7）甲基化检测联合其他分子标记物的筛查、诊断和预后作用仍需深入探索，如宫颈癌筛查中宿主靶基因和HPVDNA甲基化的联合检测，卵巢癌中宿主靶基因甲基化和突变检测的联合效果等。这些方面可以克服甲基化检测的局限和片面之处。（8）甲基化的产业化探索仍然期待医疗、社区和产业平台的合作和努力。针对这些不足的创新、改革和深入研究，是未来的主要研究方向。甲基化检测试验步骤相对简单，生物信息学解读门槛不高，具有可靠的准确性和重复性，在妇科肿瘤的筛查、诊断和随访中的地位日益重要。未来对甲基化检测人群的扩大性探索、检测方案的深入化研究，是妇科肿瘤中甲基化研究的重要方向。参考文献（略）