2.《猕猴桃无病毒种苗生产技术规程》征求意见稿编制说明.docx

舜猴桃无病毒种苗生产技术规程编制说明（征求意见稿）编写单位：西北农林科技大学2024年3月一、工作概况1.1 任务来源本标准是根据陕西省市场监督管理局关于下达2022年陕西省地方标准制修订计划项目的通知要求起草，项目编号SDBXMUl-2022。1.2 目的与意义殊猴桃原产于中国，是一种营养价值极高的水果，有“VC之王”之称，在全球水果生产中占有重要位置。目前全球有30多个国家栽培舜猴桃，主产国有中国、意大利、新西兰和智利。截至2019年年底，全球栽培面积已达36.3万公顷，产量达430万吨。其中我国的栽培规模最大，栽培面积29.1万公顷，产量300.6万吨，分别占世界物猴桃栽培面积和产量的80.2%和69.9%。陕西作为中国最大的狒猴桃产区，栽培面积及产量分别占全国的30%和40%o然而，近年来随着骄猴桃栽培面积的不断扩大，掰猴桃病毒病的扩散和蔓延也成为威胁掰猴桃安全生产的隐患之一。目前，共鉴定出24种可侵染物猴桃的病毒，包括12种新病毒和12种已知的、狮猴桃是其新寄主的病毒，而在我国栽培掰猴桃中鉴定出的病毒有17种。舜猴桃感染病毒后通常会表现出叶片花叶、斑驳、褪绿和畸形等症状,严重时会引起树干枯死、树皮开裂、果实大小不均匀等症状，极大影响产量和质量，造成严重经济损失。有研究指出，狒猴桃病毒病在陕西不同地区，不同掰猴桃种及品种上广泛发生，且对陕西舜猴桃产量及品质造成了严重影响。植物病毒是专性细胞内寄生物，只寄生在寄主的活细胞内，可通过营养繁殖世代传播，还可通过昆虫媒介从受病毒感染的植物传播到健康的植物，长期以来一直是农业生产可持续发展的制约因素。狒猴桃常通过嫁接繁殖，因此导致了病毒在林猴桃植株上的积累和传播。虽然化学药品在控制病毒病方面有潜在的应用，但培育无病毒植物才是有效控制它们的一种农业策略。目前，世界各地广泛种植无病毒植物，以控制许多重要经济作物的病毒性疾病，如块茎作物、草本观赏植物。从其他国家进口新品种及国家或地区之间交换育种材料也都需要无病毒材料。此外，植物种质资源保存也强调使用无病毒植物。因此，建立狮猴桃病毒脱除技术体系，制定“狮猴桃脱毒种苗生产技术规程”具有重要的生产及经济意义，为后续舜猴桃脱毒苗的生产提供理论基础和技术支持。1.3 主要工作过程项目任务下达后，立即成立了猫猴桃无病毒种苗生产技术规程地方标准起草小组,组织起草小组对测试标准的意义和总体技术要求进行学习，制定了本标准的工作方案、技术路线、主要研究方法，标准的具体格式，确定了标准的总体框架和制定原则，明确了标准制定的具体工作计划和进度。起草小组通过多年自身试验研究资料的整理，结合对其他同行业无病毒种苗生产的数据资料的研究等方法，在总结起草单位多年来掰猴桃无病毒种苗培育和实践的基础上，全面开展了该标准的制定工作。1.4 起草单位标准由西北农林科技大学主导，杨凌梦绿生态农业有限责任公司协助起草。1.5 起草组成员及任务分工姓名性别职务/职称工作单位任务分工刘占德男研究员西北农林科技大学总负责，主持制订张阿玲女博士生西北农林科技大学试验研究数据整理史遐女硕士西北农林科技大学试验研究数据整理刘艳飞女副研究员西北农林科技大学标准编制和修改贺浩浩男农艺师眉县果业技术推广服务中心实施试验高志雄男高级农艺师杨凌梦绿生态农业有限责任公司试验示范二、标准编写原则和研究内容包括标准编制所遵循的原则，以及标准结构、要素、技术要求、关键指标的确定依据和主要内容；地方标准修订项目还应当列出和原标准主要差异情况。本标准遵循适用性、先进性、统一性和协调性的原则，始终将经济效益、生态效益和社会效益有机结合，协调统一。本标准共有8章，严格按照GB/T1.1-2020的规定编写，本标准包括封面、引言、名称、适用范围、术语和定义、要求等要素。主要内容包括标准的适用范围、术语和定义、脱毒原理、病毒检测与脱除、无病毒母本园的建立、无病毒苗木的繁育、无病毒苗木出圃及包装标识等。三、实证研究本标准实施验证工作开展了大量的试验，尤其是对于狒猴桃病毒检测与脱除方法进行了系统的研究，确定了关键技术指标。3.1 化学疗法脱毒处理利巴韦林浓度筛选对感染ACVA、ACVB和ACCRaV三种病毒的大籽掰猴桃试管苗使用0、25、50、75、100mg1.的利巴韦林增殖培养基上培养42d,对使用不同浓度利巴韦林进行处理的试管苗生长状况进行观测并拍照记录，结果如图3-1所示，在处理的第14d,使用25、50、75mg1.利巴韦林处理植株的生长情况一致与对照植株相似。在处理的28d,随着利巴韦林浓度的升高，植株生长变化明显，利巴韦林浓度为50mg1.时，植株长势最好,利巴韦林浓度为100mg/1.时，植株部分叶片开始发黄，植株增殖受到轻微抑制。处理结束时(42d),试管苗生长变化明显，尤其在75、100mg1.利巴韦林浓度处理下，植物病毒感染的症状均表现在叶片上，且后者比前者症状更明显，植株的增殖受到了明显的抑制作用。与对照相比，50mg1.利巴韦林浓度下植株的长势最好。因此，得出随着利巴韦林浓度的加大，植株的生长先增强后减弱，在50mg1.的利巴韦林浓度下长势最好，所以后续脱毒试验以25、50、75mg1.利巴韦林的浓度进行处理。14dCKZTR25TR50R75ct>RlOO然28d尸，,742d，只铲1cm图3-1利巴韦林化疗后14、28和42天的离体大籽狒猴桃植株的生长情况Fig.3-1GrowthofinvitroActinidiamacrospe11naplantsafterchemotherapytreatmentswithribavirinfor14,28,and42days对照:离体大籽狒猴桃植株在标准生长室内培养;R25、R50、R75和RlOO:离体大籽狮猴桃植株在生长室中培养在添加利巴韦林的增殖培养基上，浓度分别为25、50、75>100mg1.oCK：InvitroActinidiamacrospe11naplantswereculturedinastandardgrowthroom;R2,R50andR75invitroActinidiamacrospe11naplantswereculturedinagrowthroomonMSmediumsupplementedwithribavirinat25,50and75mg1.,respectively3.2 基于化学疗法的脱毒处理对带毒试管苗营养生长和增殖的影响3.2.1 化学疗法脱毒处理对试管苗营养生长和增殖的影响将带毒大籽试管苗外施0、25、50、乃mg/1.利巴韦林在增殖培养基上培养6周后，测量不同浓度利巴韦林处理时大籽狒猴桃试管苗营养生长和增殖。营养生长统计结果如表3-1所示，在使用4个浓度利巴韦林对植株进行脱毒处理时，植株在节间数、叶长、叶宽指标上没有出现显著性差异，但是50mg1.的利巴韦林处理对植株的株高、鲜重以及叶片数产生了显著影响。高浓度利巴韦林（50mg1.）处理产生了20.4个叶片，显著高于对照组的14.4个叶片，且在株高上达到了23.26mm,显著高于对照组的15.74mm,高于25>75mg1.处理下的植株表现但不显著；节间长达到了最长的4.38mm,显著高于对照组和使用75mg1.的利巴韦林处理植株；节间数高于其他处理但不显著；鲜重、干重及干重均显著高于对照处理；仅有叶宽叶长出现了低于其他处理的现象。不同脱毒处理对“大籽”物猴桃试管苗增殖结果的影响统计结果如图3-2所示,使用50mg1.的利巴韦林处理对植株的增殖数产生了显著影响，高浓度利巴韦林(5Omg1.)处理可以增殖5.4个植株，显著高于对照组和使用R25、75mg1.的处理的3、3.8、3.6个植株。所以，在正常处理6周的条件下，随着利巴韦林浓度的上升，5Omg1.利巴韦林处理下大籽掰猴桃植株综合生长指标最好，与处理6周时植株的生长情况一致。3.2.2 化学疗法结合热处理对试管苗营养生长和增殖的影响将带毒大籽试管苗外施0、25、50、75mg1.利巴韦林在增殖培养基上培养2周，然后再经过4周的热处理后均可以成活。对该处理下试管苗营养生长和增殖状况进行测量并记录。试管苗的营养生长统计结果如表3-1所示,经过热处理后，使用25.50mg1.利巴韦林处理后的试管苗植株高度达到了24.27、25.34mm,显著高于对照组植株的13.42mm,使用75mg1.利巴韦林处理下试管苗株高为17.02mm,高于对照组植株株高但不显著。节间数、叶宽、鲜重、干重在不同浓度利巴韦林处理下和对照组无显著差异,但从增殖系数来看(图3-2),50mg1.浓度利巴韦林处理后的植株增殖系数最大为4.6,显著高于对照组和使用75mg1.处理的3.4和3.2。说明伴随着热处理脱毒，当利巴韦林浓度增加到了75mg1.时，大籽狒猴桃植株增殖受到了抑制。图32不同脱毒处理对“大籽”狒猴桃试管苗增殖系数的影响Fig.3-2EffectsofdifferentdetoxificationtreatmentcombinationsonproliferationcoefficientofActinidiamacrospe11natubeseedlings注：T代表热处理(38光下16h,32C黑暗8h)；R25、R50和R75代表利巴韦林浓度25、50和75mg1.;表示无再生，下同。Note：Trepresentsheattreatment(16hat38light,8hat32dark);R25,R50andR75representribavirin,concentrationsof25,50and75mg1.,t-'representsnoregeneration,thesameasbelow.表3-1不同浓度利巴韦林处理和不同浓度利巴韦林处理结合热处理对大籽试管苗营养生长的影响Table3-1EffectsofdifferentconcentrationsofribavirintreatmentanddifferentconcentrationsofribavirincombinedwithheattreatmentonthevegetativegrowthofActinidianacx)spermatubeseedlings处理Treatment株高/毫米Plantheight/mm节间数Nodenumber节间长/毫米Nodelength/mm茎粗/亳米Stemdiameter/mm鲜重/克Freshweight/g干重/克Dryweigh(g叶长/亳米1.eaflength/mm叶宽/毫米1.eafwidth/mm叶片数NumberofbladesCK15.74±0.84b3.6+0.16a2.66+0.33b0.99+0.05b0.35+0.04c0.05+0.00b17.71±1.54a13.22+1.15a14.40+1.38bR2522.70±1.88a4.17±0.17a3.58±0.38ab1.08±0.03ab0.48±0.03ab0.05±0.00ab20.60±0.82a13.8O±O.85a15.17±1.16bR5023.26±1.61a4.1±0.23a4.38±0.46a1.25+0.08a0.52±0.03a0.06±0.00aI9.03±0.60a13.29+0.59a20.40±1.90aR7520.28±0.83ab3.6±0.16a3.08±0.18bl.19±0.05ab0.39±0.03bc0.05±0.00ab20.45±0.96a13.61±1.20a17.30±1.02abT13.42+1.2c3.5±0.17b2.95±0.43b0.87÷0.05b0.36±0.06a0.05+0.0la18.97±1.71b13.47±1.16a11.80±I.12aT+R2524.27±23ab4.54±0.22a6.84±0.65a1.10±0.04a033±0.06a0.06±0.00a27.14±1.66a16.66±1.03a12.85±0.85aT÷R5025.34±3.25a4.4+0.16a5.35±0.65al.ll±0.04a0.41±0.06a0.06±0.01a26.37±1.30a15.32±0.68a13.70±1.54aT+R7517.02±0.96bc3.7±0.21b2.85±0.29b1.06±0.06a0.31±0.06a0.05+0.0la22.85±0.89ab13.80±1.19a12.30±0.99a注：增殖培养6周后统计结果。数据为平均数土标准误，同列中不同字母表示经TUkey，SteSt检验存在P<0.05的差异显著性。Note：Resultswererecordedafter6weeksofshootproliferation.Datawerepresentedasmeans+SEanddifferentlettersaresignificantlydifferentatP<0.05analyzedbyTukey,stest.3.3 基于化学疗法的脱毒处理对带毒试管苗病毒含量的影响图3-3所示为利用0、25、50、75mg/1.浓度的利巴韦林处理试管苗6周后，对ACVA、ACVB和ACCRaV病毒含量进行定量分析的统计结果。结果显示，使用不同浓度利巴韦林对舜猴桃试管苗进行处理后，植株中AcVA>AcVB和AcCRaV病毒的含量差异较大，当使用浓度为50mg1.利巴韦林处理时,对AcVA>ACVB的抑制效果最好，试管苗病毒含量均显著低于其他处理。对于ACCRaV病毒来说，使用75mg/1.浓度利巴韦林处理下植株病毒含量与使用25mg/1.浓度利巴韦林处理时无显著差异，但显著高于使用50mg1.利巴韦林处理，但三者对ACCRaV病毒的抑制效果均显著优于对照组。因此，利巴韦林浓度为50mg1.时对3种病毒的综合抑制效果最好，与植株生长情况结果相同。图3-3大籽物猴桃试管苗在不同浓度利巴韦林处理下的病毒含量Fig.3-3ViruscontentofActinidiamacrospermatest-tubeplantletstreatedwithdifferentconcentrationsofribavirin图3-4所示为对使用不同浓度利巴韦林进行2周的正常条件培养后再进行4周热处理后的大籽舜猴桃试管苗进行所感染3种病毒含量的定量分析结果，结果显示不同浓度利巴韦林结合热处理后对AcVA病毒含量的影响存在显著差异，Ct值的范围在28.90-31.50,其中对照组病毒含量最高为28.90,热处理结合75mg1.利巴韦林处理对ACVA的抑制效果最好；对于ACVB病毒，对照组、热处理结合25、50mg1.的处理间Ct值无显著差异，分别为28.51、28.65和28.83,但均显著高于热处理结合75mg1.的利巴韦林处理时病毒含量；对于AcCRaV,热处理结合25、50、75mg/1.利巴韦林处理后的病毒含量显著低于对照组；热处理结合25、50mg1.浓度的利巴韦林溶液处理下大籽掰猴桃试管苗的AcCRaV的病毒含量组间无显著性差异,但显著低于热处理结合75mg1.的利巴韦林处理。综上所述，热处理结合利巴韦林对三种病毒的抑制效果明显比单独使用利巴韦林处理效果好，而且使用50mg1.的利巴韦林处理两周结合热处理4周后对AcVA、AcVB和AcCRaV病毒的抑制效果最好。图3-4不同浓度利巴韦林处理结合热处理对大籽狒猴桃试管苗病毒含量的影响Fig.3-4EffectsofribavirintreatmentatdifferentconcentrationsontheviruslevelsofActinidiamacrospe11natubeseedlings注：以上试验数据用平均值土标准误来表示。不同的字母使用DImCar新复极差法在PV0.05上进行分析的显著性差异。Note：theabovetestdataareexpressedbymeansofaverageplusorminusstandarderror.SignificanceanalysiswasconductedusingDuncar,snewcomplexrangemethodtocomparethesignificanceatP<0.05.3.4 基于化学疗法的脱毒处理对试管苗成活率、再生率的影响表3-5大籽舜猴桃在不同脱毒方法组合处理下茎尖的成活率与再生率Table3-5SurvivalrateandregenerationrateofshoottipsofActinidiamacrospe11natreatedwithdifferentdetoxificationmethods处理Treatment处理时长/天Duration/days茎尖培养ShootTipCulture(STO超低温冷冻cryotherapy(Cryo)成活率/%Survival/%再生率/%Regeneration/%成活率/%Survival/%再生率/%Regeneration/%CK4289.2÷1.23c90+2.15a52+1.31c28÷2.08aR254290+0.7bc91.2+3.35a56.7±1.95b30+2.36aR504292+1.21b92+1.65a60+1.65a10±4cR754281.8+1.28d91.4+2.12a42+0.85e-T4282.4+0.8d64.3+1.25c48.2±2.08d30+0.78aT+R254294.5+1.2la85.6÷1.75b46+1.64d22±2.55bT+R504295.3+0.46a88±1.8ab20.4+1.9If-T+R754276.5+1.93e52+0.82d15±0.75g-在经过利巴韦林浓度筛选后，确定以0、25、50、75mg1.利巴韦林结合热疗法、茎尖培养和超低温疗法脱除病毒。将带毒大籽舜猴桃试管苗在不同浓度利巴韦林的增殖培养基上培养6周后，切取0.30.5mm的分生组织进行培养，并对成活率和再生率进行统计，结果如表3-5,加入利巴韦林的处理相较于对照组获得了更高的成活率和再生率。说明使用25、50mg1.浓度的利巴韦林对大籽狒猴桃茎尖进行培养，促进了其成活率和再生率的显著提高，使用50mg1.的利巴韦林对大籽'擀猴桃茎尖做脱毒处理后，茎尖的成活率得到了显著提升，由对照组的89.2%上升到了92.0%,且再生率最好，达到了92%。对大籽狒猴桃进行不同浓度利巴韦林结合热处理和茎尖培养脱毒试验中，在切取0.3-0.5mm大小的大籽狒猴桃试管苗茎尖并结合28天的热处理条件下，当使用50mg1.的利巴韦林处理时显著提高了茎尖成活率，使其成活率由82.4%提高到了95.3%,随后，茎尖的成活率开始随利巴韦林浓度的升高而下降。同样，使用50mg1.的利巴韦林处理时，大籽狒猴桃茎尖的再生率同样达到最高，为88%,但当浓度上升到75mg1.时再生率出现了显著下降，只有52%,说明热处理可能会对茎尖的成活和再生产生负面效应。对大籽狮猴桃进行不同浓度利巴韦林结合超低温疗法脱毒试验中，在含有0、25、50、75mg1.利巴韦林的增殖培养基中培养6周后，取1.5-2.0mm的茎尖进行冷冻，利巴韦林浓度为50mg1.时，茎尖的成活率最高，为60%,显著高于对照的53.4%,随着利巴韦林浓度的加大，75mg1.处理时的成活率出现了显著下降，只有42%,再生率为0%。25mg1.利巴韦林处理时，达到本处理的最高茎尖成活率，为30%。说明大籽狒猴桃在经历高浓度的利巴韦林再进行超低温冷冻后，其成活和再生都会受到影响。对大籽狒猴桃进行不同浓度利巴韦林结合热处理和超低温疗法脱毒试验中，茎尖的成活率与再生率均显著低于仅使用利巴韦林处理结合超低温疗法中植株水平，对照组植株的成活率和再生率最高分别为52%和30%O随着利巴韦林浓度的升高，成活率和再生率逐渐变低，50mg1.的利巴韦林处理下茎尖成活率只有20.4%,显著低于仅使用热处理结合超低温冷冻的脱毒处理成活率水平，并且没有获得再生苗。说明使用利巴韦林结合热处理和超低温疗法进行脱毒处理后，对茎尖的成活和再生均造成了不利影响，因此，使用利巴韦林结合热处理和超低温疗法方法不适用于大籽狮猴桃脱毒。3.5 基于化学疗法的脱毒处理对再生苗脱毒率的影响表3-6化学疗法或化疗结合热处理对大籽狒猴桃带毒试管苗茎尖培养脱除病毒的影响Table3-6EffectsofchemotherapyorthermotherapycombinedwithchemotherapyonviruseradicationOfShOOttipCUltUreinVitroOfAainidiamacrospermaTreatment处理茎尖培养的脱毒率()ViruseradicationbyShoottipculture(%)AcVAAcVBAcCRaVTotalCK70(21/30)83.3(25/30)60(18/30)60(18/30)R2593.3(28/30)96.6(29/30)93.3(28/30)83.3(25/30)R5096.7(29/30)100(30/30)96.7(29/30)93.3(28/30)R75100(30/30)100(30/30)96.7(29/30)96.7(29/30)T86.7(26/30)93.3(28/30)66.7(20/30)66.7(20/30)T+R2596.7(29/30)100(3O3O)100(30/30)96.7(29/30)T+R50100(30/30)100(30/30)100(30/30)100(30/30)T+R75100(30/30)100(30/30)100(30/30)100(30/30)表3-7化学疗法或化疗结合热处理对大籽狒猴桃带毒试管苗超低温冷冻后脱除病毒影响Table3-7EffectsofchemotherapyorthermotherapycombinedwithchemotherapyonviruseradicationofcryotherapyinvitroofActinidiamacrospernuTreatment处理超低温冷冻后的脱毒率(%)ViruseradicationbyCryotherapy(%)AcVAAcVBAcCRaVTotalCK84.6(11/13)69.2(9/13)30.7(4/13)30.7(4/13)R2593.3(14/15)93.3(14/15)53.3(8/15)53.3(8/15)R50100(4/4)100(4/4)75(3/4)75(3/4)R75-T100(7/7)100(7/7)100(7/7)100(7/7)T÷R25100(2/2)100(2/2)100(2/2)100(2/2)T+R50-T+R75-注：括号中的数字代表RT-PCR病毒检测的阴性样本数/检测样本总数，“T”代表“Thermotherapyno为没有获得再生苗。Note:Thenumbersinbracketsrepresentthenumberofnegativesamples/totalnumberofsamplestestedforRT-PCRvirus,with"T"representing"Thermotherapy"."-"indicatesnoregeneratedseedlings.对不同浓度利巴韦林结合茎尖培养和不同浓度利巴韦林结合热疗和茎尖培养进行脱毒率的统计与分析的结果如表36所示。结果表明，培养基中添加利巴韦林明显提升了茎尖培养脱毒率，且利巴韦林浓度越高脱毒率越高，75mg1.利巴韦林处理时可以100%脱除AcVA和AcVB病毒，同时使AcCRaV病毒的脱毒率达至J96.7%,50mg1.利巴韦林处理后也可以100%脱除ACVB病毒。随着利巴韦林浓度的增加，脱除三种病毒的效率越来高，显著高于对照组60%的脱除率。化学疗法结合热处理和超低温疗法脱毒得到的再生苗，在50、75mg1.利巴韦林处理下对ACVA、ACVB和ACCRaV病毒的脱除率均达到了100%,25mg1.利巴韦林处理下对AcVB和AcCRaV的脱除率均达到了100%,只有2株再生苗没有脱除AcVAo而不含利巴韦林热处理后茎尖培养下脱除ACVA、AcVB和AcCRaV热处理后茎尖的脱毒率只有66.7%。化疗法结合热处理，大大地提高了病毒脱除的效率。对不同浓度利巴韦林结合超低温冷冻培养和不同浓度利巴韦林结合热处理和超低温冷冻培养的统计与分析如表37所示。不同浓度利巴韦林结合超低温冷冻培养下，植株成活率和再生率效果差，50mg1.利巴韦林处理只得到了4株再生苗，所以只能对4株再生苗进行病毒检测，得到了100%ACVA和ACVB的脱毒率，ACCRaV的脱毒率只有75%。利巴韦林浓度为75mg1.时，茎尖的再生率为0%,高浓度的利巴韦林进行超低温冷冻后抑制了茎尖的再生，导致无再生苗;当利巴韦林浓度为25mg1.时，分别得到了93.3%AcVA和AcVB病毒脱除率，和53.8%的ACCRaV病毒脱除率。显著高于对照植株30.7%的病毒脱除率。不同浓度利巴韦林结合热处理之后再进行冷冻培养，茎尖再生后可以得到100%脱除ACVA、ACVB和ACCRaV病毒的再生苗。当利巴韦林为50和75mg1.时，热处理冷冻后茎尖的再生率为0%,所以没能得到脱除ACVA、ACVB和ACCRaV的再生苗。和25mg1.的利巴韦林热处理结合超低温冷冻后，均得到了100%的脱毒率，但加入利巴韦林后茎尖的成活和再生均降低。说明使用超低温结合热处理能够提高病毒脱除效率，但会降低植株再生率，但这种脱毒方法组合再使用利巴韦林化学疗法会大大降低茎尖再生率。使用利巴韦林化学疗法和超低温冷冻方法组合进行脱毒，得到的茎尖脱毒率较低，但茎尖成活率高于前者。3.6 辨猴桃病毒超低温脱除技术研究表3-8狒猴桃病毒超低温脱除方法比较Treatment茎尖大小(mm)茎再生率(%)脱除率AcVA(%)脱除率ACVB(%)脱除率AcCRaV(%)03-0.591.375(15/20)70(14/20)15(3/20)Mc0.5-193.315(3/20)45(9/20)5(1/20)1-210010(2/20)20(4/20)O(0/20)0.3-0.572.2100(20/20)90(18/20)60(12/20)Th+Mc0.5-194.480(16/20)80(16/20)45(9/20)1-210050(10/20)55(11/20)15(3/20)Cryo0.5-115.6100(14/14)92.9(13/14)64.3(9/14)1-225.630(6/20)75(15/20)O(0/20)Th+Cryo0.5-18.9100(8/8)87.5(7/8)50(4/8)1-24070(14/20)90(18/20)45(9/20)研究发现，茎尖越小再生率越低，脱毒率越高；热处理结合茎尖培养和热处理结合超低温比单独使用茎尖培养或超低温疗法的茎尖再生率低，但脱毒率更高。其中热处理结合0.5lmm的茎尖超低温疗法的脱毒效果最好，其次是热处理结合0.3-0.5mm的茎尖培养。3.7 舜猴桃脱毒苗评价CKAcVA->upousalql图3-5脱毒前后物猴桃叶片颜色比较脱毒后，褪绿症状明显减轻甚至消失。定量结果表明热处理后ACVA及AcVB的含量显著降低，且试管苗上部的病毒含量显著低于下部，而ACCRaV含量热处理前后及不同部位无显著性差异，从而解释了AcVA与AcVB比ACCRaV更易脱除的原因。（图35）VFVAVABV图3-6脱毒前后舜猴桃植株大小比较感染2种以上病毒会显著降低试管苗株高，茎粗，节间长及叶片数，但对增殖系数无显著影响。（图3-6）图37脱毒前后殊猴桃根系的比较脱毒后，掰猴桃无病毒苗的根系数量多，根系长。（图3-7）图脱毒苗与带毒苗整休比较整体来讲，经过脱除的狒猴桃无病毒苗木，叶片、根系及植物生长均显著优于带毒苗。（图38）3.7舜猴桃无病毒种苗生产其它配套相关技术研究图3-9狒猴桃病毒病田间症状图3-10RT-PCR检测赫猴桃病毒(bp)MN123750500250图3-11物猴桃病毒超低温脱除体系图3-12超低温脱毒苗叶片再生模式图3-12期猴桃无病毒苗木图3-13脱毒苗微体嫁接技术图3-14脱毒苗微根接杆插技术图3/5舜猴桃无病毒成品苗四、知识产权说明本标准是经过多年试验、示范的结果，在研究的过程中，产生多篇论文与专利，主要包括基于化学疗法的大籽掰猴桃病毒脱除方法优化研究、狒猴桃病毒检测与脱除技术研究等学位论文，及CombiningthermotheraPyWithShOOttiPcultureorcryotherapyforimprovedviruseradicationfrominvitroActinidiaInacrosperma>Invitrochemotherapy-basedmethodsforviruseliminationfromAC加NhcmSPe切74等科技论文，以及一种舜猴桃微根接托插方法等专利。五、采标情况目前狒猴桃无病毒苗木生产技术规程方面，在国内外暂无等同和等效的相关标准，本标准在充分实验研究与验证的基础上，根据陕西舜猴桃苗木生产实际需求，首次对相关技术指标或要求进行规范。六、重大意见分歧的处理暂无。七、其它应说明的事项无。