显微镜成像方法与技术3.ppt

第三讲、电子显微镜镜,电子显微镜,电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前透射电镜的分辨力可达0.2nm。,电镜的分类,电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质成分分析；发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。,电镜的分辨本领,在光学中，分辨率（分辨极限）即指光学仪器可以分辨的两个物点之间的最小距离。由于瑞利斑（爱里斑）的关系，显微镜物镜的分辨极限为：0.61/n sin 式中为入射光波长，n是物方介质的折射率，2为物镜对物体的张角（孔径角），n sin为物镜的数值孔径，以N.A.表示。通过增大数值孔径或缩短光源波长都可以提高物镜的分辨率。从增大数值孔径N.A.来提高分辨率是很有限和困难的，最有效的方法是缩短光源的波长，电镜所采用的电子波长为：12.25/V 可见，只要提高加速电压V就可以得到短波长的电子波，分辨率也就相应得到提高。,一、透射电镜,透射式电子显微镜（TEM，Transmission Electron Microscopy，亦称投射式电子显微镜）因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿，可以直接获得一个样本的投影。通过改变物镜的透镜系统人们可以直接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本的晶体结构。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。由于电子需要穿过样本，因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低，样本就必须越薄。样品较薄或密度较低的部分，电子束散射较少，这样就有较多的电子通过物镜光栏，参与成像，在图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密，则像的对比度就会恶化，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。,JEM-2010F透射电镜,第一部实际工作的TEM，现在在德国慕尼黑的遗址博物馆展出。,工作原理,透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。,基本的TEM光学元件布局图,TEM的结构,TEM由几大部分组成：照明系统；成像系统；记录系统；真空系统；电气系统。1.照明系统 主要由电子枪和聚光镜组成。电子枪 是发射电子的照明源。聚光镜 是把电子枪发射出来的电子束进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。,电子枪的构成,2.成像系统 即电子光学系统，又称镜筒，是透射电镜的主体。成像系统主要由物镜、中间镜和投影镜组成。物镜 是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜 分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。物镜是一个强激磁短焦距的透镜，它的放大倍数较高，一般为100-300倍。目前，高质量的物镜其分辨率可达0.1nm左右。中间镜 是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在0-20倍范围调节。当M1时，用来进一步放大物镜的像；当M1时，用来缩小物镜的像。在电镜操作过程中，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。,TEM分裂极靴设计透镜示意图,投影镜 的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像（电子衍射花样）进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小（约10-3rad），因此它的景深和像距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。有时，中间镜的像平面还会出现一定的位移，由于这个位移距离仍处于投影镜的景深范围之内，因此，在荧光屏上的图像仍旧是清晰的。电子图像的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之乘积。,3.观察和记录装置包括荧光屏和照相机构。在荧光屏下面放置一下可以自动换片的照相暗盒，照相时只要把荧光屏竖起，电子束即可使照相底片曝光。由于透射电子显微镜的焦长很大，虽然荧光屏和底片之间有数十厘米的间距，仍能得到清晰的图像。,TEM的电子源在顶端，透镜系统（4、7、8）将电子束聚焦于样品上，随后将其投影在显示屏（10）上。控制电子束的设备位于右方（13和14）。,4.真空系统 真空系统的作用有两方面，一方面可以在阴极和地之间加以很高的电压，而不会将空气击穿产生电弧，另一方面可以将电子和空气原子的撞击频率减小到可以忽略的量级，这个效应通常使用平均自由程来描述。标准的TEM需要将电子的通路抽成气压很低的真空，通常需要达到104 帕。由于TEM的元件如样品夹具和胶卷盒需要经常插入电子束通路，或者需要更换，因此系统需要能够重新抽成真空。因此，TEM不能采用永久密封的方法来保持真空，而是需要装备多个抽气系统以及气闸。,样品制备,透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。透射电镜样品制备：取材（小于1立方毫米）固定脱水包埋固化切片（50-60 nm）双染色电镜观察,莱卡超薄切片机,TEM 样品支撑网格，其上有一超薄切片。,一个单轴倾斜样品夹具，它可以插入TEM的测角仪。倾斜这个夹具可以通过旋转整个测角仪来实现。,内质网透射电镜图（伪彩色）,冰冻蚀刻电镜照片,TEM的局限性,上世纪，TEM的最佳分辨率为1.4（日本日立制作最新型300万伏超高压电子显微镜）。由于电子透镜球面像差的限制，也由于生物样品的反差不足，电镜分辨率不能达到理论的极限值1的水平。电子显微镜的分辨本领虽已远胜于光学显微镜，但电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电镜对于电子束通道（即镜筒内腔）的真空度要求很高，镜筒部分真空的好坏是决定电镜能否正常工作的关键之一。因为在电镜中，高速电子与气体的相互作用，会使高速电子散射而偏离直线轨道，所以要使镜筒中的残余气体尽量的减少以保证电子的自由行程。电镜镜筒中的电子行程约为1m，经计算真空度应为1.33X10-1Pa。一般超高压电镜的真空度可达到这个水平。,二、扫描电镜,扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）的制造是依据电子与物质的相互作用。当一束高能的入射电子轰击物质表面时，被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征X射线和连续谱X射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。同时，也可产生电子-空穴对、晶格振动(声子)、电子振荡(等离子体)。原则上讲，利用电子和物质的相互作用，可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。扫描电子显微镜正是根据上述不同信息产生的机理，采用不同的信息检测器，使选择检测得以实现。如对二次电子、背散射电子的采集，可得到有关物质微观形貌的信息；对x射线的采集，可得到物质化学成分的信息。正因如此，根据不同需求，可制造出功能配置不同的扫描电子显微镜。,二次电子 Secondary electron 二次电子是指被入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核和外层价电子间的结合能很小，当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能的能量后，可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生在比较接近样品表层处，那些能量大于材料逸出功的自由电子可从样品表面逸出，变成真空中的自由电子，即二次电子。二次电子来自表面5-10nm的区域，能量为0-50eV。它对试样表面状态非常敏感，能有效地显示试样表面的微观形貌。由于它发自试样表层，入射电子还没有被多次反射，因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别，所以二次电子的分辨率较高，一般可达到5-10nm。扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨率。二次电子产额随原子序数的变化不大，它主要取决于表面形貌。入射电子与样品核外电子碰撞，使样品表面的核外电子被激发出来，作为SEM的成像信号，代表样品表面的结构特点。,SEM的构成,扫描电子显微镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。1.真空系统 主要包括真空泵和真空柱两部分。真空柱是一个密封的柱形容器。成象系统和电子束系统均内置在真空柱中。2.电子束系统 由电子枪和电磁透镜两部分组成，主要用于产生一束能量分布极窄的、电子能量确定的电子束用以扫描成象。电子枪用于产生电子，主要有两大类。一类是利用场致发射效应产生电子，另一类是利用热发射效应产生电子。电磁透镜 热发射电子需要电磁透镜来成束，所以在用热发射电子枪的SEM上，电磁透镜必不可少。通常会装配两组，汇聚透镜和物镜。汇聚透镜用于汇聚电子束，装配在真空柱中，位于电子枪之下。通常不止一个，并有一组汇聚光圈与之相配。但汇聚透镜仅仅用于汇聚电子束，与成象会焦无关。物镜为真空柱中最下方的一个电磁透镜，它负责将电子束的焦点汇聚到样品表面。,3.成像系统 电子经过一系列电磁透镜成束后，打到样品上与样品相互作用，会产生次级电子、背散射电子、俄歇电子以及X射线等一系列信号。所以需要不同的探测器譬如次级电子探测器、X射线能谱分析仪等来区分这些信号以获得所需要的信息。,SEM的工作原理,由最上边电子枪发射出来的电子束，经栅极聚焦后，在加速电压作用下经过二至三个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成一个细的电子束聚焦在样品表面。在末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下使电子束在样品表面扫描。由于高能电子束与样品物质的交互作用，结果产生了各种信息：二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和透射电子等。这些信号被相应的接收器接收，经放大后送到显像管的栅极上，调制显像管的亮度。由于经过扫描线圈上的电流是与显像管相应的亮度一一对应，也就是说，电子束打到样品上一点时，在显像管荧光屏上就出现一个亮点。扫描电镜就是这样采用逐点成像的方法，把样品表面不同的特征，按顺序，成比例地转换为视频信号，完成一帧图像，从而使我们在荧光屏上观察到样品表面的各种特征图像。,扫描电镜原理示意图,SEM基本参数,1.放大率 与普通光学显微镜不同，在SEM中，是通过控制扫描区域的大小来控制放大率的。如果需要更高的放大率，只需要扫描更小的一块面积就可以了。放大率由屏幕或照片面积除以扫描面积得到。所以，SEM中，透镜与放大率无关。2.场深（景深）在SEM中，位于焦平面上下的一小层区域内的样品点都可以得到良好的会焦而成象。这一小层的厚度称为场深，通常为几纳米厚，所以，SEM可以用于纳米级样品的三维成像。3.分辨率 在理想情况下，二次电子像分辨率等于电子束斑直径。4.作用体积 电子束不仅仅与样品表层原子发生作用，它实际上与一定厚度范围内的样品原子发生作用，所以存在一个作用“体积”。作用体积的厚度因信号的不同而不同。,5.工作距离 指从物镜到样品最高点的垂直距离。如果增加工作距离，可以在其他条件不变的情况下获得更大的场深。如果减少工作距离，则可以在其他条件不变的情况下获得更高的分辨率。通常使用的工作距离在5毫米到10毫米之间。6.成像 次级电子和背散射电子可以用于成像，但后者不如前者，所以通常使用次级电子。7.表面分析 俄歇电子、特征X射线、背散射电子的产生过程均与样品原子性质有关，所以可以用于成分分析。但由于电子束只能穿透样品表面很浅的一层（参见作用体积），所以只能用于表面分析。表面分析以特征X射线分析最常用，所用到的探测器有两种：能谱分析仪与波谱分析仪。前者速度快但精度不高，后者非常精确，可以检测到“痕迹元素”的存在但耗时太长。,样品处理,在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。一、样品的初步处理 取材：面积可达8mm*8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上。清洗：将样品表面的血液、组织液或粘液等附着物清洗干净。固定：固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。脱水：样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后浸入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。,二、样品的干燥 扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种：(一)空气干燥法 空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。(二)临界点干燥法 临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约23小时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。(三)冷冻干燥法 冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤。,三、样品的导电处理 生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种：(一)金属镀膜法 金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。(二)组织导电法 用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属溶液对生物样品中的蛋白质脂类和醣类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。,JEOL扫描电子显微镜,人类血细胞SEM照片,第四讲、扫描探针显微镜,扫描探针显微镜,扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope，SPM）是扫描隧道显微镜及在扫描隧道显微镜的基础上发展起来的各种新型探针显微镜的统称，是国际上近年发展起来的表面分析仪器，是综合运用光电子技术、激光技术、微弱信号检测技术、精密机械设计和加工、自动控制技术、数字信号处理技术、应用光学技术、计算机高速采集和控制及高分辨图形处理技术等现代科技成果的光、机、电一体化的高科技产品。,扫描探针显微镜的分类,一、扫描隧道显微镜STM；二、扫描力显微镜SFM：包括原子力显微镜AFM、摩擦力显微镜LFM、磁力显微镜MFM、静电力显微镜EFM和和化学力显微镜CFM。,一、扫描隧道显微镜,不用任何电子光学系统，仅用一个微小的针尖在离样品10的地方进行扫描，测定其隧道电流就可得到显微图像，这种在结构上比电镜筒简单得多但得到很高的放大率而且没有像差的设备，就叫做扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）。STM作为一种扫描探针显微术工具，可以观察和定位单个原子，它具有比它的同类原子力显微镜更加高的分辨率。此外，扫描隧道显微镜在低温下（4K，开氏度=摄氏度+273.15）可以利用探针尖端精确操纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。STM使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物化性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广泛的应用前景，被国际科学界公认为20世纪80年代世界十大科技成就之一。,STM成像原理,隧道贯穿：经典物理学认为样品表面是分明的，发生在表面的反射会限囿住电子，因此不存在电子云。量子力学认为，电子的行为就像是波，其位置是“弥散”的，物质表面之外也有电子存在。在物质表面之外的空间里发现电子的几率，随着与表面距离的增大而呈指数式的衰减。电子就像是在表面边界上穿挖隧道而出。这一效应叫做隧道贯穿。,Z1nm IT Ve-k0Z Z：间距V：偏压,用一针尖只有原子线度的极细探针贴着样品的表面轮廓进行扫描，由于电子云的密度随距离指数式的发生变化，故隧道电流对探针尖端和样品表面的距离极其敏感，距离即使改变一个原子的直径大小，隧道电流会变化一千倍。,STM工作原理,利用隧道电流的这种灵敏性，可对样品表面上的一个个原子在竖直方向上的位置进行极为精确的测量。探针在表面上方扫动时，利用压电陶瓷材料随加入电压不同可伸缩的压电效应来控制针尖距离从而对样品进行连续平行线方式的扫描，并用电子反馈线路控制隧道电流恒定记录高度的变化，或以高度恒定的方式记录隧道电流的变化，经计算机处理后，在荧光屏上或绘图机上显示出来，便可得到样品表面原子级分辨的三维图像。,工作模式,恒电流模式 利用一套电子反馈线路控制隧道电流 I，使其保持恒定。再通过计算机系统控制针尖在样品表面扫描，使针尖沿x、y两个方向作二维运动。由于要控制隧道电流 I 不变，针尖与样品表面之间的局域距离也会保持不变，因而针尖就会随着样品表面的高低起伏而作相同的起伏运动，高度的信息也就由此反映出来。这就是说，STM得到了样品表面的三维立体信息。这种工作方式获取图象信息全面，显微图象质量高，应用广泛。,STM恒电流工作方式观测超细金属微粒,恒电流工作模式示意图,恒高度模式 在对样品进行扫描过程中保持针尖的绝对高度不变；于是针尖与样品表面的局域距离将发生变化，隧道电流I的大小也随着发生变化；通过计算机记录隧道电流的变化，并转换成图像信号显示出来，即得到了STM显微图像。这种工作方式仅适用于样品表面较平坦、且组成成分单一(如由同一种原子组成)的情形。,恒高度工作模式示意图,STM基本结构,隧道针尖三维扫描控制器减震系统电子学控制系统在线扫描控制系统离线数据分析软件,隧道针尖,隧道针尖的结构是扫描隧道显微技术要解决的主要问题之一。针尖的大小、形状和化学同一性不仅影响着STM图像的分辨率和图像的形状，而且也影响着测定的电子态。针尖要求只有一个稳定的原子，针尖的化学纯度要高。针尖表面往往覆盖着一层氧化层，或吸附一定的杂质，这经常是造成隧道电流不稳、噪音大和STM图像的不可预期性的原因。因此，每次实验前，都要对针尖进行处理，一般用化学法清洗，去除表面的氧化层及杂质，保证针尖具有良好的导电性。,三维扫描控制器,由于仪器中要控制针尖在样品表面进行高精度的扫描，用普通机械的控制是很难达到这一要求的。目前普遍使用压电陶瓷材料作为x-y-z扫描控制器件。压电陶瓷利用了压电现象。所谓的压电现象是指某种类型的晶体在受到机械力发生形变时会产生电场，或给晶体加一电场时晶体会产生物理形变的现象。许多化合物的单晶，如石英等都具有压电性质，但目前广泛采用的是多晶陶瓷材料，例如钛酸锆酸铅Pb(Ti,Zr)O3(简称PZT)和钛酸钡等。压电陶瓷材料能以简单的方式将1mV-1000V的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米的位移。,减震系统和电子学控制系统,减震系统由于仪器工作时针尖与样品的间距一般小于1nm，同时隧道电流与隧道间隙成指数关系，因此任何微小的震动都会对仪器的稳定性产生影响。必须隔绝的两种类型的扰动是震动和冲击，其中震动隔绝是最主要的。隔绝震动主要从考虑外界震动的频率与仪器的固有频率入手。电子学控制系统 STM是一个纳米级的随动系统，因此，电子学控制系统也是一个重要的部分。STM要用计算机控制步进电机的驱动，使探针逼近样品，进入隧道区，而后要不断采集隧道电流，在恒电流模式中还要将隧道电流与设定值相比较，再通过反馈系统控制探针的进与退，从而保持隧道电流的稳定。所有这些功能，都是通过电子学控制系统来实现的。,STM的优势和局限性,电镜EM：要求高真空（容易使大分子脱水）和外源高压电子束（辐照损伤）。扫描隧道显微镜STM：原子级空间分辨率（横向分辨率0.1nm，纵向分辨率优于0.01nm），不使用自由粒子，无需有透镜和专门的电子源，能在近天然的条件下对单个生物大分子进行直接观察。STM及其相关技术的发展导致了纳米科学技术（研究和应用0.1nm到100nm尺度上的原子、分子现象）的产生。而纳生物学是纳米科学技术与分子生物学结合的产物，其核心技术是STM。但是，由于STM工作时监测的是针尖和样品之间隧道电流的变化，因此它只能直接观察导体和半导体的表面结构，这使STM在应用上有很大的局限性。,硅111面77原子重构象为了得到表面清洁的硅片单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。,这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。,扫描隧道显微镜拍摄下的细胞,二、原子力显微镜,原子力显微镜（Atomic Force Microscope，AFM），一种可用来研究包括绝缘体在内的材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。,AFM的原理,AFM是一种利用原子分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针，被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针很靠近样品时，其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像，就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。,二极管激光器（Laser Diode）发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂（Cantilever）背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器（Detector）。在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力，微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。反馈回路(Feedback)的作用就是在工作过程中，由探针得到探针-样品相互作用的强度，来改变加在样品扫描器垂直方向的电压，从而使样品扫描器伸缩，调节探针和被测样品间的距离，反过来控制探针-样品相互作用的强度，实现反馈控制。,原子力显微镜的优缺点,相对于SEM，AFM具有许多优点。不同于EM只能提供二维图像，AFM提供真正的三维表面图。同时，AFM不需要对样品的任何特殊处理，如镀铜或碳，这种处理对样品会造成不可逆转的伤害。第三，EM需要运行在高真空条件下，AFM在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作。这样可以用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织。和SEM相比，AFM的缺点在于成像范围太小，速度慢，受探头的影响太大。AFM是继STM（扫描隧道显微镜）之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器，可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测，或者直接进行纳米操纵；现已广泛应用于半导体、纳米功能材料、生物、化工、食品、医药研究和科研院所各种纳米相关学科的研究实验等领域中，成为纳米科学研究的基本工具。AFM与STM相比，由于能观测非导电样品，因此具有更为广泛的适用性。当前在科学研究和工业界广泛使用的扫描力显微镜（Scanning Force Microscope），其基础就是原子力显微镜。,AFM构成,主要由带针尖的微悬臂、微悬臂运动检测装置、监控其运动的反馈回路、使样品进行扫描的压电陶瓷扫描器件、计算机控制的图像采集显示及处理系统组成。在AFM的系统中，所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。所以在本系统中是使用微小悬臂（cantilever）来检测原子之间力的变化量。微悬臂通常由一个一般100500m长和大约500nm5m厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖，用来检测样品针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格，例如：长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状，而这些规格的选择是依照样品的特性，以及操作模式的不同，而选择不同类型的探针。,当针尖与样品之间有了相互作用之后，会使得悬臂cantilever摆动，所以当激光照射在微悬臂的末端时，其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变，这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号，以供SPM控制器作信号处理。将信号经由激光检测器取入之后，在反馈系统中会将此信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖保持一定的作用力。,AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。压电陶瓷是一种性能奇特的材料，当在压电陶瓷对称的两个端面加上电压时，压电陶瓷会按特定的方向伸长或缩短。而伸长或缩短的尺寸与所加的电压的大小成线性关系。也就是说，可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X，Y，Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状，通过控制X，Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的；通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。,工作模式,原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式：接触模式(contact mode)，非接触模式(non-contact mode)和敲击模式(tapping mode)。1.从概念上来理解，接触模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那样，AFM 在整个扫描成像过程之中，探针针尖始终与样品表面保持紧密的接触，而相互作用力是排斥力。扫描时，悬臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构，力的大小范围在10-1010-6 N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力，便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。,2.非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方510 nm 的距离处振荡。这时，样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制，通常为10-12 N，样品不会被破坏，而且针尖也不会被污染，特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥，将针尖与表面吸在一起，从而增加尖端对表面的压力。3.敲击模式介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡，针尖仅仅是周期性地短暂地接触（敲击）样品表面。这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时，AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描，装置随即将有关数据输入系统，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等，用于物体表面分析。同时，AFM 还可以完成力的测量工作，测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。,三种模式的比较,1.接触模式（Contact Mode）：优点：扫描速度快，是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM。垂直方向上有明显变化的质硬样品，有时更适于用Contact Mode扫描成像。缺点：横向力影响图像质量。在空气中，因为样品表面吸附液层的毛细作用，使针尖与样品之间的粘着力很大。横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低，而且针尖刮擦样品会损坏软质样品（如生物样品，聚合体等）。2.非接触模式（Non-Contact Mode）：优点：没有力作用于样品表面。缺点：由于针尖与样品分离，横向分辨率低；为了避免接触吸附层而导致针尖胶粘，其扫描速度低于Tapping Mode和Contact Mode AFM。通常仅用于非常怕水的样品，吸附液层必须薄，如果太厚，针尖会陷入液层，引起反馈不稳，刮擦样品。由于上述缺点，Non-contact Mode的使用受到限制。3.轻敲模式（Tapping Mode）：优点：很好的消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力，图像分辨率高，适于观测软、易碎、或胶粘性样品，不会损伤其表面。缺点：比Contact Mode AFM 的扫描速度慢。,AFM的应用,因为AFM的工作范围很宽，可以在自然状态（空气或者液体）下对生物医学样品直接进行成像，分辨率也很高。因此，AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一。AFM应用主要包括三个方面：生物细胞的表面形态观测；生物大分子的结构及其他性质的观测研究；生物分子之间力谱曲线的观测。1.AFM对生物细胞的表面形态观察 AFM可以用来对细胞进行形态学观察，并进行图像的分析。通过观察细胞表面形态和三维结构，可以获得细胞的表面积、厚度、宽度和体积等的量化参数等。例如，利用AFM可以对感染病毒后的细胞表面形态的改变、造骨细胞在加入底物（钴铬、钛、钛钒等）后细胞形态和细胞弹性的变化、GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究。利用AFM还可以对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构进行研究，直接观察到自由基损伤，以及加女贞子保护作用后，对红细胞膜分子形态学的影响。,2.生物大分子的结构及其他性质的观测研究 对于蛋白质，AFM的出现极大的推动了其研究进展。AFM可以观察一些常见的蛋白质，诸如白蛋白，血红蛋白，胰岛素及分子马达和噬菌调理素吸附在固体界面上的行为，对于了解生物相溶性，体外细胞的生长，蛋白质的纯化，膜中毒有很大帮助。AFM液相成像技术的优点在于消除了毛细作用力，针尖粘滞力，更重要的是可以在接近生理条件下考察DNA 的单分子行为。AFM 作为一种纵向分辨率达0.1 nm，横向分辨率为2 nm 左右的表面分析技术，已广泛地用于表征各类DNA-蛋白质的复合物。利用AFM 直接成像方法，可以对固定的活细胞和亚细胞结构进行深入研究。这些研究获得了关于细胞器的构造，细胞膜和细胞骨架更详细的信息。将细胞固定在基底上再进行AFM 观察，可以得到细胞膜结构的皱褶，层状脂肪物，微端丝和微绒毛等特征。由于细胞质膜掩盖了细胞内部骨架，现在已经发展了一种仔细剥离该层膜的方法，并利用AFM 对剥离细胞膜后的结构进行了研究。AFM 在细胞研究方面的一个最重要用途是对活细胞的动力学过程，细胞间的相互作用以及细胞对其内外干扰因素的响应进行实时成像。目前，AFM已经可以对外来病毒感染的细胞进行实时考察。AFM还可以研究活性状态下血小板形状的变化情况和培养的胰腺细胞对淀粉消化酶的响应情况。,3.生物分子之间力谱曲线的观测。对生物分子表面的各种相互作用力进行测量，是AFM的一个十分重要的功能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的。因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥，接近或者离开，化学键的形成或者断裂，生物分子立体构像的维持或者改变等等。将两种分子分别固定于AFM的基底和探针尖端上。然后使带有一种分子的探针尖端在垂直方向上不断地接近和离开基底上的另一种分子。这时，两种分子间的相互作用力，就是二者间的相对距离的函数。这种力与距离间的函数关系曲线,称之为力谱曲线。,