《化妆品毒理学试验方法样品前处理通则》及相应检验方法等19项.docx

国家药监局关于将化妆品毒理学试验方法样品前处理通则等19项制修订项目纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2024年第12号）国家药品监督管理局组织起草了化妆品毒理学试验方法样品前处理通则等19项制修订项目并形成相应检验方法，经化妆品标准专家委员会全体会议审议通过，现予以发布。其中,化妆品毒理学试验方法样品前处理通则漕12项制定项目（详见附件2-12）为新增检验方法,纳入化妆品安全技术规范（2015年版）（详见附件1）,自2024年12月1日起实施。化妆品中二嗯烷的检验方法化妆品中二甲硝咪嘎等120种原料的检验方法化妆品中二硫化硒的检验方法（详见附件13-15）为修订的检验方法，替换化妆品安全技术规范（2015年版）中原有检验方法（详见附件1）。自2024年12月1日起，化妆品注册、备案及抽样检验相关检验应当采用本通告发布的检验方法。比马前列素、拉坦前列素、他氟前列素、他氟乙酰胺、曲伏前列素为新增禁用物质，纳入化妆品安全技术规范（2015年版）（详见附件1）,自发布之日起实施。附件：1.化妆品安全技术规范19项制修订项目情况汇总表2 .化妆品毒理学试验方法样品前处理通则3 .急性吸入毒性试验方法4 .急性吸入毒性试验急性毒性分类法5 .光反应性活性氧（ROS）测定试验方法6 .体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法7 .皮肤吸收体内试验方法8 .28天重复剂量经口毒性试验方法9 .28天重复剂量吸入毒性试验方法10 .90天重复剂量吸入毒性试验方法11 .扩展一代生殖发育毒性试验方法12 .两代生殖发育毒性试验方法13 .化妆品中二嗯烷的检验方法14 .化妆品中二甲硝咪嘤等120种原料的检验方法15 .化妆品中二硫化硒的检验方法国家药监局2024年3月18日理I国家药品监督管理局2024年第12号通告附件lxd.doc电）家药品监督管理局2024年第12号通告附件2.docx型国家药品监督管理局2024年第12号通告附件3.docx电）家药品监督管理局2024年第12号通告附件4.doci¾家药品监督管理局2024年第12号通告附件5docx电）家药品监督管理局2024年第12号通告附件6.docx物国家药品监督管理局2024年第12号通告附件7.doc司国家药品监督管理局2024年第12号通告附件8.doc劭国家药品监督管理局2024年第12号通告附件9.doci¾家药品监督管理局2024年第12号通告附件10.doc唠国家药品监督管理局2024年第12号通告附件ILdocx理I国家药品监督管理局2024年第12号通告附件12docx物国家药品监督管理局2024年第12号通告附件13.doc现国家药品监督管理局2024年第12号通告附件14docx迓）国家药品监督管理局2024年第12号通告附件15.docx化妆品安全技术规范19项制修订项目情况汇总表序号项目名称类型建议纳入化妆品安全技术规范的章节同时废止的化妆品安全技术规范中原章节内容1化妆品毒理学试验方法样品前处理通则增验法新检方第六章毒理学试验方法33化妆品毒理学试验方法样品前处理通则2急性吸入毒性试验方法第六章毒理学试验方法34急性吸入毒性试验方法3急性吸入毒性试验急性毒性分类法第六章毒理学试验方法35急性吸入毒性试验急性毒性分类法4光反应性活性氧(ROS)测定试验方法第六章毒理学试验方法36光反应性活性氧(ROS)测定试验方法5体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法第六章毒理学试验方法37体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法6皮肤吸收体内试验方法第六章毒理学试验方法38皮肤吸收体内试验方法728天重复剂量经口毒性试验方法第六章毒理学试验方法3928天重复剂量经口毒性试验方法828天重复剂量吸入毒性试验方法第六章毒理学试验方法4028天重复剂量吸入毒性试验方法990天重复剂量吸入毒性试验方法第六章毒理学试验方法4190天重复剂量吸入毒性试验方法序号项目名称类型建议纳入化妆品安全技术规范的章节同时废止的化妆品安全技术规范中原章节内容10扩展一代生殖发育毒性试验方法第六章毒理学试验方法42扩展一代生殖发育毒性试验方法11两代生殖发育毒性试验方法第六章毒理学试验方法43两代生殖发育毒性试验方法12比马前列素用录增禁目新第二章化妆品禁限用组分表1序号1286A13拉坦前列素第二章化妆品禁限用组分表1序号128714他氟前列素第二章化妆品禁限用组分表1序号128815他氟乙酰胺第二章化妆品禁限用组分表1序号128916曲伏前列素第二章化妆品禁限用组分表1序号129017化妆品中二嗯烷的检验方法订替原验法修后换检方第四章理化检验方法2禁用组分检验方法2.19化妆品中二嗯烷的检验方法第四章理化检验方法2禁用组分检验方法2.19二嗯烷18化妆品中二甲硝咪嗖等120种原料的检验方法第四章理化检验方法2禁用组分检验方法2.35化妆品中二甲硝咪唾等120种原料的检验方法第四章理化检验方法2禁用组分检验方法2.1氟康哇等9种组分、2.2盐酸美满霉素等7种组分、2.3依诺沙星等10种组分、2.35化妆品中抗感染类药物的检测方法（序号出自国家药品监督管理局2019年第66号通告）序号项目名称类型建议纳入化妆品安全技术规范的章节同时废止的化妆品安全技术规范中原章节内容19化妆品中二硫化硒的检验方法第四章理化检验方法3限用组分检验方法3.2化妆品中二硫化硒的检验方法第四章理化检验方法3限用组分检验方法3.2二硫化硒化妆品毒理学试验方法样品前处理通则GeneralRuleforPretreatmentofCosmeticinToxicologicalExperiments1范围本规范规定了化妆品毒理学试验样品前处理的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料和产品的毒理学试验检测。2试验目的在毒理学试验开始之前，首先应对样品进行前处理操作，通过样品前处理可以增加受试物与试验体系（包括实验动物、细胞、细菌等）的接触，增加样品吸收率，使样品性状更利于试验操作，保证毒理学试验的科学性和严谨性。3定义3.1前处理指在毒理学试验开始前，对受试样品进行溶解、研磨、混匀、赋形、剂量分组、合理保存等一系列的准备性操作。4前处理的基本原则化妆品原料和产品的前处理方式需要综合考虑样品的理化性质和毒理学试验方案。对于化妆品原料而言，应根据受试物的理化特性和染毒方式确定前处理方法。对于化妆品产品而言，则主要考虑化妆品产品的物理性状和实际应用中的使用方法。化妆品原料和产品的样品前处理均需遵守现用现配原则。5前处理方法根据毒理学试验的要求，需要对样品进行前处理的准备工作。受试物的处理不能改变其原有的毒理学性质。受试物进行不同试验时，应结合毒理学试验项目的染毒方式和受试物的理化性质进行相应的前处理工作。5.1 溶剂的选择化妆品前处理应不改变样品的毒理学性质。当样品需要溶解时，应注意溶剂的选择，以保证样品充分溶解或混悬。样品的前处理稀释倍数应保证最终供试品浓度不低于实际使用浓度。溶剂的选择应充分了解其毒理特性。溶剂应无特殊刺激性或气味，本身应不产生毒性作用，与受试物各成分之间不发生化学反应，且保持其稳定性，如使用其他溶剂应说明理由。体外遗传毒性试验中,所选溶剂必须是非致突变物,且不能影响细胞或细菌存活以及S9的活性。细菌回复突变试验常用溶剂首选无菌蒸储水，其次DMS0、四氢吠喃、丙酮等。细胞试验常用溶剂首选培养液（不含血清）或无菌蒸储水，其次DMS0、丙酮、甘油等；使用有机溶剂时，终浓度应符合具体试验项目的要求，一般而言，DMSo使用终浓度不应大于0.5%,丙酮和甘油使用终浓度不应大于l%o5.2 化妆品原料化妆品原料的前处理方法主要取决于样品的物理形态和染毒方式，具体如下：5.2.1 液态（1）准备器材：一次性注射器（2mL-5mL）,无菌离心管（15mL方OmL）,移液枪（0.1L-5mL）,量筒（IOmL）,烧杯，旋涡混匀仪，水相/有机相滤器（0.22mQ45m）,溶剂等。（2）取样：根据毒理学试验项目、染毒方式以及样品原液性质计算各剂量组稀释倍数，然后用一次性注射器或移液枪量取相应体积的样品原液，加入适宜溶剂中，并充分混匀。也可应用等比例稀释法。若样品原液为多介质分层液体，应上下摇晃，使其充分混匀后，再做稀释分组。若毒理学试验项目未明确要求剂量分组时，可使用一次性注射器或移液枪直接量取样品原液。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品原液的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。样品配制应适量，遵守现用现配的原则，防止样品在储存过程中发生变质或变性。5.2.2固态（1）准备器材：研钵，电子天平，称量纸，称量勺，量筒（IOmL）,烧杯，无菌离心管（15ml50mL）,旋涡混匀仪，水相/有机相滤器（0.22mQ45m）,移液枪（0.1L-5mL）,溶剂等。（2）取样：首先根据样品物理性状，考虑是否需要研磨，若样品原样为细粉状，则无需研磨；否则，应先使用研钵，将块状、膏状等固体性状，充分研磨成细粉状或糊状。然后根据毒理学试验项目、染毒方式以及样品原样性质计算各剂量组浓度，用电子天平称量相应重量的样品，加入适宜溶剂中，并充分混匀。若毒理学试验项目未明确要求分剂量组时，可直接用电子天平称量相应重量的样品；如果试验项目为经皮染毒时，可考虑用最小体积的溶剂将样品湿化成无散落粉末且无多余溶剂的状态，或在正式试验时，先湿化皮肤。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品原样的储存方式选择干燥通风的环境，室温或冷藏暂放或避光。样品配制应适量，遵守现用现配的原则，防止样品在储存过程中发生潮化或变质。5.23 难溶样品难以溶解于无机溶剂或有机溶剂的难溶样品，常见处理方法有（1）使用样品浸提液。根据样品理化性质选择适宜浸提介质、浸提比例、浸提温度、浸提时间和浸提方法，并提供相应说明。样品浸提液应对皮肤无毒副作用。（2）加入悬浮剂或赋形剂，使样品悬浮其中，形成分布均匀的悬浮混合物。悬浮剂或赋形剂应对皮肤无毒副作用、无色无味，且稳定性高。常见的悬浮剂及赋形剂有：玉米油、淀粉、明胶等。5.24 妆品产品化妆品产品进行毒理学试验的前处理工作时，主要根据化妆品产品剂型分类处理，此外，还需要考虑化妆品的实际使用方法等因素。5.24.1 体剂型化妆品产品化妆品中的液体剂型（露、液、水、油、油水分离等），除宫、霜、蜜、脂以外的膏霜乳剂型（乳、乳液、奶、奶液等）、凝胶剂型（睹口厘、胶等）等流动性的化妆品产品均可参照521处理。乳化类的液体产品稀释时，需根据产品特征选择脂溶性或水溶性溶剂。5.24.2 体剂型化妆品产品化妆品中青霜乳类中的膏体、霜类、蜜、脂，以及粉剂剂型（散粉、颗粒等），块状剂型（块状粉、大块固体等），泥状剂型（泥状固体等），蜡基剂型（以蜡为主要基料的产品）等固体化妆品产品的前处理方式可参照5.2.2处理。5.24.3 贴类化妆品产品化妆品中贴、膜、含基材剂型（贴、膜、含配合化妆品使用的基材类）的化妆品产品前处理方法如下：（1）准备器材：取剪刀，一次性注射器（2mL-5mL）,移液枪（0.1L-5mL）,量筒（IOmL）,溶剂等。（2）取样：根据毒理学试验项目和产品的使用方式，如若经皮接触，先用剪刀将样品裁剪成适宜的形状（如2.5X2.5Cm的方块），比如含基质材料的面膜类；当原产品形状不足尺寸时，可叠加多个直到满足形状要求，比如痘痘贴类；如若经眼睛接触，可将样品液从产品袋中挤出，然后按照5.2.1处理。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。5.24.4 配比使用的化妆品产品染发剂等按比例配制使用的化妆品，其前处理工作应与产品实际使用方法保持一致，具体如下:（1）准备器材：一次性注射器（2mL-5mL）,移液枪（0.1g-5mL）,量筒（IOmL）,电子天平,旋涡混匀仪等。（2）取样：根据化妆品产品的使用说明，用电子天平或一次性注射器或移液枪定量取相应质量的各组分样品，然后充分均匀。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。此类化妆品产品应严格遵守现用现配原则。5.24.5 雾剂剂型及喷雾剂剂型化妆品产品化妆品中气雾剂剂型（含推进剂）及喷雾剂剂型的化妆品前处理如下：（1）准备器材：烧杯，一次性注射器（2mL-5mL）,移液枪（0.1L-5mL）等。（2）取样：一般情况下，首先将样品喷至烧杯容器中，收集其液体，再按照5.2.1处理。若样品因为蒸发而无法收集时，可模拟产品的实际使用方法，直接将产品在受试动物正前方IOCm处喷射，此距离可根据喷雾压力及内容物做出适度调整。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染或挥发，根据样品原液的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。5.24.6 有特殊使用方法的化妆品产品若产品备注有特殊使用方法，如需要加热、溶解等操作，如冻干粉、浴盐等，应在前处理时，按照样品的实际使用方法，尽可能保持受试物在实际使用中的形态。此类化妆品产品的配制应注意现用现配的原则。化妆品原料和产品为其他特殊性状时，应综合考虑受试物理化特性和人群接触特征，选择不影响受试物毒理学特性的前处理方式。6注意事项经皮染毒时，溶剂应另外注意不影响受试物穿透皮肤，保证受试物与皮肤有良好接触，常用的介质有蒸谭水、羊毛脂、凡士林。经口染毒时，受试物均应溶解于适宜的溶剂中，在选择溶剂时应不高于经口染毒液体的最大容量，啮齿类动物所给液体容量一般为ImL/100g,水溶液可至2mL100g°通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。吸入染毒时，受试物须在空气中保持一定浓度，必要时可加入适当的赋形剂。赋形剂本身应无毒性，不与受试物反应且不影响受试物的吸收。在体外试验中，需要注意无菌条件，化妆品原料和产品的酸碱度不能影响细胞或细菌的正常生长，若化妆品原料和产品为强酸强碱（pH2或PH"1.5）,可不再做皮肤刺激性/腐蚀性试验和急性眼刺激性/腐蚀性试验。急性吸入毒性试验方法AcuteInhalationToxicilyStudy1范围本规范规定了动物急性吸入毒性试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品单一成分的原料安全性毒理学检测。2试验目的急性吸入毒性试验可评价化妆品原料能否被直接吸入或者通过其他途径进入呼吸道所产生的毒性反应，可对受试物进行毒性分级，为亚急性毒性和其他毒理学研究中染毒浓度选择提供依据。3定义3.1 急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity实验动物短时间（24h内）持续吸入一种可吸入性受试物后，在短期内出现的健康损害效应。3.2 半数致死浓度（LCso）medianlethalconcentration在一定时间内经呼吸道吸入受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量，以单位体积空气中受试物的质量（mgm3）来表示。3.3 空气动力学直径aerodynamicequivalentdiameter（AD）气溶胶颗粒与不同直径标准单位密度（LOg/cn?）球形颗粒中某颗粒的终端沉降速度相同时,该标准球形颗粒的直径即为空气动力学直径。其计量单位为m.3.4 质量中值空气动力学直径massmedianaerodynamicdiameter（MMAD）气溶胶中小于和等于某一空气动力学直径的颗粒总质量，占全部颗粒物质量50%时，该直径即为空气动力学质量中位数直径。3.5 几何标准差geometricstandarddeviation（GSD）用以描述气溶胶颗粒大小的分布状态。以撞击器各级累积百分比为丫轴、粒径为X轴拟合对数概率曲线，以累积百分比84.1%对应的粒径除以累积百分比50%的粒径，即为几何标准差。4试验的基本原则受试物通过吸入暴露装置制备成不同浓度的样品，各试验组动物在一定时间内吸入不同浓度的受试物，暴露浓度的选择可通过预试验确定，吸入暴露后观察动物的毒性反应和死亡情况，试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时存活的动物要处死进行大体解剖。5试验方法5.1 受试物试验前受试物的有用信息包括：受试物的特性（如纯度），化学结构和理化性质；任何体外或者体内性试验结果：预期用途和人体暴露的可能性；得到的结构类似物的构效关系数据和毒理数据,在研究中，尽可能使用一组受试物，而且其样本应该在能保持其纯度、稳定性的条件下保存。受试物的准备：可对受试物进行适当处理，使其达到适当浓度和粒径。如果是颗粒材料可经过机械加工，以达到所需的粒度分布，但不要分解或者改变供试品，如果在机械过程中已经被认为改变了物品组分时，应对受试物成分进行验证，验证如果不产生可吸入颗粒，则不需要进行吸入毒性试验，否则应进行吸入毒性试验。5.2 实验动物和饲养环境常规选择啮齿类动物，首选大鼠，一般选用812周龄的大鼠，使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的。如需使用其他品系需说明理由。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的±20%。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应35d时间。染毒前，动物应提前适应口鼻暴露时所用的固定器，以减少进入新环境引起的不适。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。5.3 染毒浓度在试验开始前，通常要进行预试验，为主试验的浓度选择提供帮助，受试物己知或预期有毒则进行限度试验。用全球化学品统一分类和标签系统（GHS）的分类系统，气体、蒸气、溶胶的限定浓度分别为20000ppm、20mg/L和5mgL0传统LC50试验至少设置3个不同浓度的染毒组，每组动物一般为10只，雌雄各半。各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试，以便能在各浓度组的试验动物中发生一定程度毒效应和死亡。所得资料应足以绘制出浓度一死亡曲线，并在可能情况下求出LCso值。5.4 暴露方式根据受试物的性质和试验目的来选择吸入染毒方式，首选的暴露方式为口鼻式暴露，特别是在研窕液体或固体气溶胶或者可凝结成为气溶胶的蒸气时。对于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒装置以更好地满足研究需求，但应在试验报告中予以阐释说明。采用全身暴露染毒时应保证染毒柜中气流的稳定性，试验动物的总体积不能超过染毒柜容积的5%o5.5 暴露条件口鼻式暴露时间推荐为4h,暴露期间应禁食，在全身暴露时可以提供水。如果需更长时间的研究，应提供理由。1.1.1 传统的LCso法在传统法中，暴露时间为4ho动物暴露在一个限定浓度（限度试验），或在至少3个不同的浓度下（主试验）。除已知受试物信息外，在开展主试验前，需要进行预试验。预试验：预试验可用来估计受试物的毒性效应，确定易感性的性别差异，并为限度试验或主试验的浓度选择提供帮助。在选择预试验的浓度水平时，应该充分使用所有可得的信息，比如现有的定量一构效关系（Q）SAR数据和类似化学品的数据。试验中，每个浓度水平的每种性别的试验动物不超过3只，通常只有一个浓度水平。已经进行过的急性吸入毒性试验一急性毒性分类法研究可以用来替代预试验。限度试验：当受试物已知或预期基本无毒时，可采用限度试验。受试物的毒性作用信息，可以来源于已测试过的类似化合物或混合物或产品的特性和具有毒理意义的组成成分。在限度试验中，雌雄各3只动物暴露在限定浓度中。如果在限定浓度发现动物死亡或濒死，则限度试验的结果可作为其他浓度试验（如主试验）的预试验。如果受试物的理化性质决定其不可能达到限定浓度，则需测试其最大可及浓度。如果最大可及浓度的死亡率小于50%,则不需进行进一步试验。主试验：进行主试验时，一般每个浓度组有10只动物，雌雄各半（或5只易感性别的动物），且至少有3个浓度水平。必须有足够多的浓度水平足以绘制出浓度死亡曲线，并在可能情况下求出LC50各暴露组之间的时间间隔取决于中毒体征的出现、持续时间与严重程度。是否需要对下浓度水平进行试验，取决于先前的试验动物是否能够成活。1.1.2 浓度一时间法浓度一时间法是传统LCso法的另一种替代方法。这种方法使试验动物暴露在不同浓度的受试物水平，而且暴露时间也不同。所有的试验都采用口鼻部吸入的方法。与传统法相比，浓度一时间法得到的LCoi与LGOO的值更加稳定。当在4个浓度水平和5种暴露持续时间的主试验采用浓度一时间法时，每个浓度一时间间隔只需使用2只动物（雌雄各半或易受影响的单一性别）.在某些情况下，在每浓度一时间间隔，可以选择两种性别的动物各2只，这能减少参数估计的误差和变异性，增加成功率，提高置信区间的覆盖范围。当用来参数估计的数据拟合不好时，可能需要第5个浓度水平。预试验：预试验一般用各性别、各浓度3只动物，它可以为主试验选择1个合适的初始浓度和最大化减少动物使用。暴露时间为4ho如果能从急性吸入毒性试验一急性毒性分类法中得到死亡数据，那么可以不进行预试验。在选择研究中的初始目标浓度时，应该考虑在急性吸入毒性试验一急性毒性分类法中观察到的各性别和各个浓度的死亡率。主试验：初始浓度（第一步暴露）可能是限定浓度，也可根据预试验选择浓度。每组雌雄各1只动物暴露于此浓度下，持续时间不同（如15、30、60、120、240min）,总共用到10只动物。限定浓度可根据监管要求选择，气体、蒸气、气溶胶的限定浓度分别为20000PPm、20mg/L、5mg/L（或为最大可及浓度），如果在第一步暴露中发现死亡，则引起死亡的最小暴露浓度将为下一步试验的浓度建立提供指导，每一个后续的试验都将取决于先前的试验结果。当供试品物理或化学性质无法达到极限浓度时，应测试可达到的最大浓度。如果在可达到的最大浓度下，致死率低于50%,则不需要进行下一步的测试，如果不能达到极限浓度，研究报告应提供说明和数据支持，如果可达到的最大蒸汽浓度不会引起毒性，则可能需要将供试品作为液体气溶胶产生。对于很多受试物，如果暴露时间间隔适当，在初始浓度得到的结果与在其他3个浓度组得到的结果，就能足以绘制浓度一时间一死亡曲线。5.7 暴露条件的监测5.7.1 浓度监测试验期间为保证实际浓度的稳定性，可以使用实时监测设备（如气溶胶光度计），或定期通过特异性的方法（如采用撞击器吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行化学分析），或非特异性的方法如滤膜采样法来测定呼吸区或染毒柜内气溶胶浓度，以保证暴露条件的稳定性。对于气体和蒸汽，单个腔室浓度样品的平均浓度不得超过±10%,对于液体或固体气溶胶，平均浓度不应超过±20%,应计算和记录腔室的平衡时间（t95）。5.7.2 粒径监测在发生系统中，应进行粒度分析，以确保气溶胶浓度的稳定性。推荐可吸入质量中值空气动力学直径（MMAD）应该在l4m,几何标准差（o）在1.53.00在染毒期间，需经常进行粒度分析,以测定粒度分布的一致性。如达不到要求，应说明理由。气溶胶粒径的测定需在染毒4小时内至少采样2次，可采用级联撞击采样器或其他设备如气体动力学粒径仪等，粒径分析所得质量浓度应处于由漉膜分析法所得质量浓度的合理的限度范围内。5.7.3暴露系统内环境监测染毒装置内气流：染毒装置应配备动态气流，口鼻吸入染毒过程中应使装置内保持轻度负压，全身暴露装置染毒柜内应密闭，以防止受试物泄露到外部环境中。暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次，在暴露系统中，氧气浓度应至少为19%,二氧化碳浓度不得超过1%,如果达不到要求，应定期监测氧气和二氧化碳浓度。染毒装置内温度保持在22±3°C,口鼻暴露和全身暴露都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，试验期间应至少监测和记录三次，较短时间内每半小时测一次。理想的相对湿度一般在30%70%,但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水溶液型受试物时），应在试验报告中予以阐释说明。5.8 临床观察在暴露刚开始当天至少进行两次临床观察，或者根据动物反应，进行更频繁观察。观察期限最少为14d,以后每天至少进行一次观察。中毒体征出现和消失的时间都十分重要，特别是在有中毒体征延迟趋势时。动物濒死、疼痛剧烈与严重且持久的痛苦皆应予以安乐死。当动物被安乐死，或者发现死亡时，应该尽可能准确记录死亡时间。所有的观察应该被系统地记录，每个动物应该保持单独记录。观察内容应该包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循环，自主和中枢神经系统，肢体活动和行为的改变。应该记录可能的局部和全身反应的差别。要注意有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、昏睡、睡眠和昏迷症状。测试直肠温度可为出现反射性呼吸迟缓、C-纤维刺激反射或与给药方式或封闭相关的低温/而热情况提供佐证。每只动物体重应该在暴露前一天到暴露（day）,并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周），以及在第1天后的死亡或安乐死时进行记录。若动物体重出现N20%的持续递减，应该进行密切监测。在暴露结束后，应测量存活动物的体重，并实施安乐死。5.10 所有实验的动物，包括在实验中死亡的，或者出于动物福利原因被安乐死以及从试验中撤离的,应该进行大体解剖。如果动物被发现死亡后，应尽可能快地进行尸体解剖，通常在l2d内，如不能被立即进行尸体解剖，动物应该被冷藏，以尽量减少自溶。记录每个动物的大体病理变化，并特别注意呼吸道改变。其他附加检查可为研窕提供更为深入的解释价值，例如测量存活大鼠肺的重量,和/或提供呼吸道刺激性的显微镜检查证据，对死亡和存活24h及24h以上的动物中存在大体病理改变的器官进行组织病理学检查。如受试物对水有反应（如酸和吸湿性受试物），可开展整个呼吸道的显微镜检查。5.11 1.C50的计算一般可采用多种方法测定LC5o,建议采用一次最大限度试验法、霍恩氏法、概率单位一对数图解法和寇氏法等。5.12 试验结果评价5.12.1 结果处理应该提供每只动物的体重和尸检发现的数据。临床观察数据应该以表格的形式呈现，统计出各实验组使用的动物的数量，出现特殊中毒特征的动物数量，实验中死亡或者人道处死的动物数量，动物个体的死亡时间，毒副作用的描述和时间进程，可逆体征以及尸检发现。5.12.2 结果评价评价试验结果时，应将LC50与观察到的毒性效应和尸检结果相结合考虑，LCso值是受试物急性揖性分级及判定受试物经呼吸道吸入后引起动物死亡可能性大小的依据，引用LCso值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、暴露方式及时间长短、观察期限等。评价应包括受试物吸入暴露剂量与动物异常表现（包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应及其他毒性作用）的发生率和严重程度之间的关系。毒性分级见表1。表1吸入毒性分级分级气体（PPm）蒸气(mgL,4h)粉尘和雾（mgL,4h）第1类LC5o00LC5o0.5LC5o0.05第2类100<LC5o500O.5<LC5o2.OO.O5<LC5oO.5第3类5OO<LC5o25OO2.O<LC5o1O0.5VLCsoW1.0第4类25OO<LC5o2OOOO1O<LC5o2O1.O<LC5o5第5类>20000>20>5注：分类标准引用全球化学品统一分类和标签制度（GHS）o第5类的标准旨在识别急毒性危险相对较低,但在某些环境下可能对易受害人群造成危险的物质，这些物质的LCso范围预计值分别为:气体大于20000ppm,蒸气大于20mgL,粉尘和雾大于5mgL,如果现有的可靠证据表明LCso在第5类的数值范围内，或者其他动物研究或人类毒性效应表明对人类健康有急性影响，那么物质划入此类别。为保护动物，不应在第5类范围内对动物进行试验，只有在这样的试验结果与保护人类健康直接相关的可能性非常大时，才应考虑进行这样的试验。6试验结果的解释急性吸入毒性试验研究和LCso的测定，可评价受试物的急性吸入毒性及其毒性等级，其结果外推到人类的有效性很有限。急性吸入毒性试验急性毒性分类法AcuteInhalationToxicity-AcuteToxicClassMethod1范围本试验方法规定了急性吸入毒性试验急性毒性分类法的试验原则、试验方法、数据和报告。本试验方法适用于化妆品原料急性吸入毒性的急性毒性分类。本试验方法适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。本试验方法不适用于测试某些特殊的材料.，如难溶的等轴状(isometric)或纤维状(fibrous)材料、或人造纳米材料(manufacturednanomaterials)。2试验目的本试验方法的目的是通过测试获得受试物的健康危害信息等资料，从而可参考联合国全球化学品分类和标签管理协调制度(theUnitedNations(UN)GloballyHarmonizedSystem(GHS)ofClassificationandLabellingOfChemicaIs)的化学品急性毒性分类标准对其急性毒性进行分类。3定义3.1 急性吸入毒性分类法按照一定的连续试验步骤和相应的浓度进行测试，从而获得受试物的毒性分类和半数致死浓度(LC50,LethalConcentration50%)估测范围的试验方法。3.2 计算浓度nominalconcentration使用受试物的量除以通过染毒系统空气的总体积所得到的浓度。3.3 实际浓度actualconcentration在吸入式染毒柜中动物呼吸道中的受试物浓度，可通过特异性(如直接采样、吸附或化学反应等方法进行采样、分析)或非特异性(如滤膜增重法)等方法进行测试分析。4试验原则本试验采用分步试验的方法，观察试验动物暴露4h的反应，从而得到满足对受试物急性吸入毒性等级进行分类的信息。为了特殊的监管目的也可采用其他暴露时限(不是4h)的试验。每步试验使用每种性别3只动物，在确定的浓度下进行吸入暴露试验。根据动物死亡和/或濒死状态，有时只进行2步试验操作就可以对受试物的急性吸入毒性类别做出判断。如果有证据表明某种性别的动物比另外一种动物的敏感性要高时，可以只使用敏感性别动物进行试验。前面一步操作的试验结果决定着下步试验操作：a）无需进行下一步试验；b）每性别3只动物；或c）只使用6只敏感性别的动物。方法是每个试验浓度组使用6只敏感性别的动物，性别不限，以估测的毒性类别界限范围数值中较低的浓度来进行试验。对濒临死亡的、处于难以忍受疼痛的或严重持久痛苦的动物，应人道地处死。人道处死的试验动物，在结果统计时应与试验中死亡的动物一并对待。5试验方法5.1 方法描述5.1.1 动物种属的选择应使用健康年轻、实验室中常用的种属动物进行试验。首选大鼠，如使用其他动物应进行论证,说明理由和依据。5.1.2 动物的准备雌性动物应是未经产的、未妊娠。要保证每步试验暴露时的鼠龄在8W12W：试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的±20%。采用随机选择原则，并对每只动物做出标记。在进行试验之前至少要在笼内饲养5d以适应实验室饲养条件。试验前还需在试验设备中进行短期的适应训练,以减少因为进入新的设备环境造成的应激反应。5.1.3 饲养条件实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。实验动物暴露前后按性别、浓度分笼饲养，但是每笼动物的数量不能妨碍对每只实验动物的观察，并应减少由于同种相残和相互撕咬而造成实验动物信息的丢失。以口鼻式装置暴露时，需将动物放入固定管内使其适应固定管的环境。固定管不能过度的增加动物体力、热量和活动的负荷。动物的限制固定可能影响动物的体温（过热）和/或每分钟动物呼吸量。如果有资料表明这些改变没有达到可感觉到的程度，就不一定需要预先在固定管内进行适应操作。全身暴露气溶胶的动物在暴露期间需各自相隔互不接触，防止柜体内动物的相互趴卧造成被毛对气溶胶的过滤作用。除暴露期间外（暴露期间禁食），给予实验动物常规检验合格的饲料，自由饮水。采用人工照明，每12h明暗交替。5.1.4 吸入染毒装置要根据受试物的性质和试验目的来选择吸入染毒方式。首选的染毒方式是口鼻式（nose-only）暴露（其中包括仅头部暴露、鼻部暴露或口鼻部暴露三种染毒模式）。当受试物是液体、固态气溶胶和能产生气溶胶的蒸气时，首选口鼻式暴露方式。对于特殊的研究目的，也可采用全身暴露（whole-body）的染毒方式以更好地满足研究需求，但应在试验报告中予以阐释说明。为了保证全身染毒时柜体内空气中受试物的稳定性，实验动物的总体积不应超过染毒柜总容积的5%o5.2 暴露条件5.2.1 染毒浓度5.2.1.1 推荐暴露吸入时间为4h,但需除去达到浓度稳定平衡所需时间。根据特殊试验需要也可采用其他的暴露时限，但是需在试验报告中给予说明。全身暴露时动物应各自隔离互不接触，防止染毒柜内其他动物的理毛行为造成经口摄入受试物。吸入暴露期间需要禁食。全身暴露时可提供饮水。5.2.1.2 动物吸入暴露的受试物是气体、蒸气、气溶胶或是它们的混合物。试验时将受试物制备成何种物态，取决于受试物的理化性质、设定的浓度，和/或在实际加工应用中最有可能使用的物理状态等。具有吸湿性的和会发生化学反应的受试物在试验中需保证吸入的空气是干燥的。需注意避免使用发生爆炸的浓度进行试验。5.2.2 颗粒粒径的分布对所有的气溶胶和可能形成气溶胶的蒸气都需测定颗粒粒径的大小。为了使整个呼吸道都能暴露受试物，推荐的气溶胶颗粒的质量中值空气动力学直径（MaSSMedianAerodynamicDiameter,MMAD）为IHm4m,其几何标准差为1.530°需尽可能达到此标准，如技术上无法满足要求时需由专家做出评判。例如，金属烟尘比本标准的粒径要小，但是带电的粒子、纤维和吸湿性受试物（在呼吸道潮湿环境下其粒径增加）可超过这个标准。5.2.3 溶媒选择与受试物的配制为了制备具有合适浓度和粒径大小的受试物，需要使用载体溶媒，作为一条规定，水是首选的载体溶媒。颗粒物需要机械加工达到要求的粒径大小，但要注意加工中是否引起受试物的分解和变性。如机械加工改变了受试物的组成成分（如由于过度研磨、摩擦产生高温），受试物的组成要经过检测分析进行确认。需注意不要污染受试物。对不能形成可吸入性的、不易成为粉末的颗粒材料不需要进行试验。磨损试验是用来证明加工这些材料时会不会产生呼吸性颗粒物。如果经磨损试验证实可产生呼吸性颗粒物，则该材料应当进行吸入毒性试验。5.2.4 对照组不需要设立平行阴性（空气）对照。即使制备试验气体的载体溶媒不是水，也只有在没有载体溶媒历史数据的情况下才设立溶媒对照组。如果所用溶媒制备的受试物没有引起毒性，至少说明在该受试物浓度的条件下，溶媒是没有毒性的，所以不需要设立溶媒对照组。5.3 暴露条件的监测5.3.1 染毒装置内气流通过染毒柜（装置）的气流速率需严格控制，可连续在线监测记录或每次暴露期间至少每小时监测记录一次。试验所用空气中受试物浓