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2023响应型荧光探针检测神经递质的研究进展摘要神经递质是一类在神经系统中起重要作用的化学物质，其异常表达与多种神经系统疾病相关。荧光探针因高选择、高灵敏和可视化特性在众多神经递质检测方法中具有突出优势。该文主要综述了2019年以来响应型荧光探针在神经递质检测方面的新进展，介绍了6类神经递质，包括胆碱类、生物胺类、氨基酸类、神经肽类、瞟岭类以及气体信号分子。在分析各类神经递质结构和反应特点的基础上，介绍了相应探针的设计思路和反应机理。这些研究为神经递质的精确检测提供了重要的方法和理论支持，有望在神经系统疾病的早期诊断和治疗中发挥关键作用。最后展望了响应型荧光探针未来的发展趋势。神经递质是一类重要的化学信使分子，可将信息传递到其他神经元、组织或器官，使机体完成特定的生物学反应。精密的神经递质释放和受体结合过程涵盖学习、记忆、情绪调节、行为控制等多方面的功能，其调节异常与多种神经系统疾病和精神类疾病密切相关，包括缺氧缺血性脑病、运动障碍、癫痫及抑郁等。测定神经递质的浓度变化和空间分布是探索人类神经系统的重要途径，同时也可以为预防、诊断和治疗神经疾病提供关键依据。多种检测方法被应用于神经递质的研究和分析，包括高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、电化学（EC）、质谱（MS）、紫外可见光谱（UV）、荧光光谱（FL）等技术。由于人体环境存在大量的内源性成分干扰，且神经递质常处于不断更新变化和代谢的动态平衡状态，越来越多的研究人员正努力开发能够实现神经递质高时空分辨率的检测方法。荧光探针检测技术因高度的选择性、灵敏度和可视化优势得到了诸多关注，与分子医学的结合也使其在神经递质的生理功能和病理机制研究中发挥着重要作用。目前已有研究多种神经递质检测技术的相关综述，同时也有单一神经递质类型特性及其相应检测方法的介绍，但鲜有针对荧光探针检测神经递质的综合性介绍。本文全面综述了响应型荧光探针检测各类神经递质的研究进展，根据常见神经递质的化学结构和功能将其分为6类，即胆碱类、生物胺类、氨基酸类、神经肽类、瞟岭类以及气体，重点探讨了多种神经递质的荧光检测方法，并通过对不同神经递质的综合分析，更深入地理解神经系统的调控机制，探讨当前荧光探针技术在神经递质检测领域存在的挑战和未来发展方向，以期为相关神经疾病的诊断和治疗提供新的视角和策略。1神经递质主要分析方法神经递质结构功能复杂，开发针对性的检测方法一直是神经科学的重大课题，科学家们已经尝试了许多不同的方法来测定体内外的神经递质，相关分析技术也在不断发展。HPLC、CE和EC等技术均可用于生物样品中神经递质的检测。如表1所示，HPLC较为常见，且可与ECxMS、UV以及FL等不同检测器结合使用，实现多种神经递质的测量。Lendor等使用固相微萃取-高效液相色谱-串联质谱（SPME-HPLC-MS/MS）实现了神经递质的原位定量连续检测。Zhang等和NoV北。VW等采用高效液相色谱-荧光（HPLC-FL）联用方法测定神经递质，检出限（LOD）可低至nmol/L级别。毛细管电泳也是检测神经递质的经典方法，毛细管电泳/电喷雾质谱（CE/ESI-MS）技术、毛细管电泳激光诱导荧光检测方法（CE-LIF）、场放大样本注射-毛细管电泳-电喷雾质谱（FaSI-CE-ESI-MS）方法均能成功分离多种神经递质。止匕外，电化学传感可通过采用纳米材料、微电机、晶体管并结合表面增强拉曼（SERS）等多种策略来增强其在神经递质检测中的稳健性、选择性和灵敏度。Ma等2022年开发的微电极可实现100nmolL-25molL多巴胺（DA）的检测，LOD为50nmolLo表1生物样品中神经递质的传统检测方法MethodTargetRSD济LODRef.HPLC-EC天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（CIU）等<8.0100-200>g5ng23HPLC-Ms/MSDA4去甲ffUSjJf(NE),-清索HT)等1.8-140.540Iwmg【245HT.Clu.>氨基丁酸(；ABA)等4.28.35.403ngml.：25OlWt(ACh),NE,-HT等0.5819<0.005mg/mL26SPME-HPLC-MS/MSDA,NE.5-HT等<174*100ngml.ioHPLC-UVAs>.Glu.RUrtS(GIy),GABA1.84.70.020.15n>oll.：27Glu,5-HT9.3-112531.25IwmL28Glu.GB0.905.40.0005mgml.；29HPLC-FLGin.GABA.D,5-HT1.9-2.90.398*1.258nnu>ll.30GABA等飒靖版类1.6-4.92.I-12nnolLIIIDA.5-HT.小NE等-0.I8-O.7nnmll.J2CEGlu.GABA-IO-100moll,13CE/ESI-MS额将酸及其对映体-<0.33moll.14CE-LlFGlu.GABA等0.80-4.5(i-2)x0,nmoll.J5FASl-CE-ESI-MSGlu.DA.5-HT等<5.0<5nn>olI.16ECDA<0.4050nmol/L22JEC-SEKSGlu-<IO'9moll.31虽然以上方法表现出对多种神经递质的良好检测性能（表1）,但是由于神经递质在生物体系中处于动态变化状态，加之样品前处理过程较为复杂、繁琐，检测时往往易形成假阳性结果，因此，准确测定生物样品中的神经递质仍然存在诸多挑战。荧光探针具有原位、快速、可视化、非破坏性实时监测的优点，能够在复杂且快速变化的生物体系中实现物质的高时空分辨率检测，精确反映物质的真实动态信息，有望成为精准监测神经递质的有效工具，解释其在神经系统中的精细调控机制。2响应型荧光探针在神经递质检测中的应用响应型荧光探针通过引入特异性识别基团，可在特定条件下对目标分析物产生可观测的光学信号变化，现已被广泛应用于生化检测、医学诊断和环境监测等领域。响应型荧光探针可以在生物体的局部理化环境中进行特异性响应，从而实现特定的用途，如靶向给药、疾病诊断治疗等，在分子医学领域也有较好的应用前景。因此利用响应型荧光探针监测神经递质的动态变化，有助于更深入地理解神经系统的功能和调控机制，推动神经科学和相关领域的研究取得更大进展。本部分将对不同类型神经递质的反应型分子荧光探针进行重点介绍，同时对基于不同材料（例如荧光蛋白、量子点、纳米材料等）的其它荧光探针进行简单概括。2.1 胆碱类胆碱是带正电荷的四价碱基，是生物膜的组成成分和乙酰胆碱（ACh）的前体。ACh（图IA）作为重要的神经递质参与自主神经传导，乙酰胆碱酯酶（AChE）起着将ACh水解成胆碱的关键作用，且特异性高,只分解以ACh为核心的有限范围的底物，因而AChE的活性测量成为胆碱类神经递质水平测量的间接策略。AChE的结构中有两个活性位点:季筱基所在的阴离子位点和作为水解催化位点的酯基位点（图1B）。图1ACh的结构（八）及AChE的结构和活性位点残基（B）Sidhu等采用乙酰胆碱模拟物方法，设计合成了荧光探针1来检测AChE（图2A）,并通过引入季筱基作为酶的假底物更好地结合AChE的活性中心。适当的距离可使探针更好地模拟ACh结构，同时能够在与酶相互作用中保持一定柔性，适应酶活性位点的微小结构变化，提高探针选择性和效能。探针1的设计考虑了季镀基和酯基之间的距离，并将其保持在23个碳单元范围。实验结果表明，AChE可催化水解荧光探针1成为1a,实现分子内电荷转移（ICT）使荧光发射增强zLOD为0.1UmLoZhao等利用光诱导电子转移（PET）建立了一种新型近红外荧光探针2（图2B）,该探针本身荧光微弱，添加AChE后荧光发生变化。在设计AChE荧光探针时，常选择氟硼口比咯（BODIPY）、双氧异佛酮和花菁类染料作为荧光团。Wei等在双氧异佛酮结构与具有激发态分子内质子转移（ESIPT）效应的苯并睡嗖荧光团偶联的基础上，选择N,N-二甲基甲酰基作为AChE的识别单元，构建了双传感机制的荧光探针3（图2C）。在无AChE的情况下，酚羟基被N,N-二甲基甲酰基保护，ESIPT和ICT过程受到抑制，荧光信号猝灭；与AChE反应脱保护后，酚羟基的供电子加强了IeT效应，并与苯并曝嗖的ESlPT效应协同作用，产生明显的荧光信号，表现出较高的灵敏度和良好的选择性，可实现生物体中内源性AChE的原位成像。图2AChE荧光探针结构及响应机制图碳量子点（CDs）、贵金属纳米颗粒、金属有机骨架材料（MOF）等也被应用于ACh的检测。其检测机理为：ACh经AChE催化反应分解为胆碱和乙酸,产物胆碱经胆碱氧化酶（ChOx）催化分解为H2O2,而CDs和金纳米颗粒（AuNCs）等材料的荧光可被H2O2猝灭。Li等构建了BSA-AUNCS修饰的双酶ACh生物传感器：牛血清白蛋白（BSA）可使Au3+还原为发光的AuNCs,而H2O2可使AuNCs的荧光猝灭。该传感器的检测范围为0.120nmol/LzLOD为5pmol/Lz相对标准偏差（RSD）为1.1%2.1%.Martin等通过共价键将含有ChOx的AuNCs与黄素腺瞟岭二核苜酸（FAD）连接，利用AuNCs与FAD之间的荧光共振能量转移（FRET）和氧气（02）对AuNCs荧光猝灭的协同作用，成功对ACh进行了检测，线性范围为110mol/LzRSD为4.0%o另一方面，Wang等通过合成Er-MOF作为电子给体，并以硫黄素T（ThT）作为受体，利用FRET及ThT与Er-MOF之间的氢键和静电相互作用，构建了双发射比例荧光传感器，线性范围为010nmol/LzLOD为0.492nmolLo此外，贵金属纳米颗粒的表面等离子体增强能量转移也可以诱导荧光猝灭，Mukhametshina等基于该机理，通过猝灭Tb（m）中心发光实现了神经肌肉连接处释放的内源性ACh的定性检测。2.2 生物胺类生物胺类神经递质,也称为单胺类神经递质（MNTS）,是含有氨基（R-NH2）的带电小分子,主要包括儿茶酚胺（CAs）、5-羟色胺（5-HT,血清素）和组胺（HA）;CAs主要指去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素和多巴胺（DA）。MNTs及其代谢产物在人体的神经、心血管和内分泌等组织系统中起着广泛的调节作用，对情绪、情感、应激行为和睡眠觉醒等生理活动具有重要影响。MNTs含量的变化与人类多种疾病密切相关，是诊断阿尔茨海默症、唐氏综合征、抑郁症和帕金森等疾病的重要依据。由于CAs结构的相似性，在利用荧光进行肾上腺素和NE的检测时，往往不做区分，同时测定二者的含量。而目前NE荧光探针的构建有以下3种设计策略：第一，基于氨基与醛基的缩合反应（图3A）。Hettie等发展了一种含有醛基识别基团的开启型香豆素衍生物荧光探针4,其与氨基反应形成亚胺离子，可使荧光增加5.3倍。图3NE荧光探针构建策略及相应探针结构第二,基于邻苯二酚基团与苯硼酸的酯化反应（图3B）。Zhang等基于瞳诺酮类荧光团构建了高亲和力的NE荧光探针5,其结构中含有硼酸识别基团，可与NE特异性结合，不受肾上腺素干扰。第三，基于羟乙胺结构的环化反应（图3C）。NE的羟乙胺部分可以通过碳酸酯或其它双键反应成环。Yue等利用该反应机理开发了特异性探针6,Zhou等利用含有磺酸基的花菁基团构建水溶性的红色荧光探针7,实现了氟西汀（一种典型的抗抑郁药）诱导体内NE升高的原位成像。并根据同一机理构建了近红外荧光探针8o止匕外，他们利用NE的羟乙胺结构与毗喃盐的特异加成反应构建特异性荧光探针9,实现了比例荧光响应。Yarl等通过在荧光团中引入相邻的醛基和酯基双位点，设计了探针10,其原理是醛基能够迅速与氨基反应，随后与-羟基进行亲核反应形成五元环；在酯基的另一个邻位引入甲氧基，可增加空间位阻，实现对NE的快速和特异性荧光检测。基于DA的结构特点,Zhao等利用硼缺电子的特性将其与DA的两个羟基基团结合，设计合成了比例荧光探针11,随着DA的加入，11a逐渐生成（图4A）,体系在484nm处的荧光强度降低，388nm处的荧光强度增加。该探针对多种潜在干扰物均无荧光响应，选择性强，检测范围为10600nmol/LzLOD为14.6nmolLo图4DA荧光探针构建策略及相应探针结构除羟基外，DA的氨基作为反应位点也被用于荧光探针构建。Deng等制备了绿色荧光蛋白荧光探针12,其内酯结构可增强荧光发射，而DA的氨基可以打开内酯生成12a（图4B）,破坏共粗结构使荧光强度降低。以CDs及其掺杂的纳米结构为基础的荧光探针在DA的实时检测中表现出高选择性、高灵敏度和快速响应的特性。Baruah等构建了CDs进行DA传感，LOD为33molLTian等制备了硼/氮共掺杂的CDs,LOD为7.88molLoTiwari等采用CDs和氮掺杂碳点作为荧光探针检测人血清中的DA,LOD为5.54molL,检测浓度范围为3.3500molLoSi等还构建了基于FRET的稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)-AgNPs纳米探针用于DA检测,发现UCNPs发射强度与DA浓度之间存在良好线性关系。Chaiendoo等基于碱性介质中DA可氧化产生聚多巴胺(PDA)的原理，构建了一种PDA包被的CDs探针用于DA检测，其独特的传感机制使之具有较强的选择性，检测范围为1.010.0molL,LOD为0.22molLo5-HT由色氨酸产生，主要分布于动物的胃肠道、血小板和中枢神经系统中。其相应的血清素能神经元几乎遍布于大脑和脊髓的每一个结构，能利用至少16种不同的受体亚型进行信号作用。目前，已有文献报道了不同受体亚型5-HT1、5-HT2、5-HT3和5-HT5、5-HT6的荧光探针。Wang等基于Mn掺杂的ZnS量子点印迹聚合物(QDsSiO2MIPs)构建了用于5-HT检测的荧光探针，当5-HT与探针结合时,QDsSiO2MIPs的氨基与5-HT的羟基形成配合物导致荧光猝灭。该材料具有较高的选择性，印迹因子为5.96,检测范围为50500ng/mLzLOD为0.69ng/mL,适用于人血清中5-HT的检测。HA作为一类重要的MNTS,广泛参与免疫、消化和神经信号的调控,但其分子调控机制尚不清楚。OShikaWa等设计了基于花菁染料的Co(11)复合物，实现了基于HA诱导的荧光信号开启检测，可用于肥大细胞中HA的测定。Wang等基于离子液体(IL)修饰的量子点和分子印迹技术合成了QDSILMlP,用于HA荧光传感检测，线性范围为0.4492.249mmol/L,LOD为0.11mmolLo2.3 氨基酸类虽然氨基酸神经递质在化学上属于生物胺的范畴，但其仍被归为单独的一类。Dalangin等总结了所有常规氨基酸以及一些最主要的非常规氨基酸在神经系统中的作用，其中包括20种常规氨基酸以及B-丙氨酸和Y-氨基丁酸，有重要的参考价值。目前为止，兴奋性氨基酸中最常见的是谷氨酸（GlU）,已被确定为中枢神经系统（CNS）的主要兴奋性神经递质。Pilicer等构建的探针13（图5）可以识别包括Glu在内的19种手性化合物。Zhao等利用毗哆醛5-磷酸（PLP）和手性1,2-二氨基环己烷,构建了基于BODIPY荧光团的D-Glu探针14,探针的PLP部分可以从环己烷的氨基上离去并与D-Glu结合，此过程中存在显著荧光变化，检测范围为00.5mmolLo图5氨基酸响应型荧光探针的结构Y-氨基丁酸（GABA）能够诱导突触前后神经元的信号转导变化，参与多种代谢活动。用于GABA检测的荧光探针相对较少,Masharina等合成了一种半合成融合蛋白GABA-Snifit,其在500700nm范围内显示出与GABA浓度相关的荧光发射光谱,可以实现微摩尔到毫摩尔浓度的GABA检测。MarVin等利用环状排列的荧光蛋白，发展了一种新的GABA荧光报告基因（iGABASnFR）变体，并在培养的神经元和小鼠脑切片中观察到线粒体对GABA的摄取和释放。氨基酸的氨基具有高反应性，而香豆素、罗丹明和BODIPY等荧光团凭借稳定的荧光特性被广泛用于氨基酸检测荧光探针的构建。探针15（图5）在香豆素结构上修饰了可与氨基反应的醛基，可实现对谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的荧光检测。荧光胺（16）是一种用于伯胺检测的商业化荧光探针，在生化分析中有着重要的应用价值。Motoyoshiya等在荧光胺的基础上构建了探针17,该探针在与甘氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸的反应性以及加合物的荧光强度方面优于荧光胺。目前，关于氨基酸响应型荧光探针的研究相对较少，该类探针可用于氨基酸在细胞内含量变化的监测、探索其间的相互作用机制以及相关疾病的发生机理。由于氨基酸结构相似且功能复杂，需要深入理解不同氨基酸特性及其在不同生物环境中的行为，以更好地开发出适用于特定需求、高特异性、高灵敏度的荧光探针。2.4 神经肽类神经肽由通过肽键连接在一起的两个或两个以上的氨基酸组成，在中枢神经系统中广泛存在且作用复杂。尽管许多开创性研究为神经肽传递的功能作用提供了重要见解，但很多基本问题在很大程度上仍未得到探索，包括神经肽在神经元网络中释放的时间和地点，在健康和疾病中释放的时空动态，以及神经肽具体的调节机制。Qian等总结了已报道的可视化神经肽传递的光学工具，包括荧光蛋白标记的神经肽、基于细胞的神经递质荧光工程报告基因（CNiFER）、受体激活测定（Tango）、基于G蛋白偶联受体（GRAB）活化荧光探针等，并概述了其设计原理、特性、优势和潜在局限性。这些工具可以提供亚秒级分辨率的神经肽传递光学成像，并具有在体内应用的潜力。2.5 D票吟类瞟岭类神经递质主要作为神经调节剂起作用,包括腺苗和三磷酸腺苜(ATP)oATP作为噤吟类神经递质中最受关注的一种，由腺瞟吟、核糖和3个磷酸基团组成，是细胞中的主要能量来源，是活细胞中的通用能量货币，也是参与三磷酸循环、离子通道和神经传递、细胞分裂、DNA合成等多种生物过程的信号介质。此外,ATP的异常与缺血、低血糖帕金森病和心血管疾病等密切相关。基于ATP的特殊形式，即具有3个带负电荷的磷酸基团、芳香族腺昔、核糖和多羟基，荧光探针可以通过带负电荷的ATP磷酸盐和带正电荷的识别基团之间的静电相互作用、电负性原子与核糖之间的共价键、大共粗结构与腺瞟吟之间的-相互作用对ATP进行检测。近些年发表了许多关于ATP荧光检测的综述：Wu等根据荧光分子的不同结构，将用于ATP检测的荧光探针分为：基于金属离子配合物、缔合物、聚嘎吩、生物分子以及多位点相互作用的荧光探针5类，同时概括了各类探针的优势。Huang等对细胞器靶向荧光ATP探针在活细胞和体内的研究进展进行了综述。他们根据探针的细胞器靶向能力将其分为不同类别，这些探针通过引入亲脂性阳离子、弱碱性基团和疏水部分，在靶向线粒体、溶酶体和细胞膜等细胞器方面取得了显著进展。其中，探针与ATP之间的相互作用涉及静电相互作用、氢键相互作用、-±隹积相互作用、开环反应以及它们的组合。另一方面，Jun等介绍了基于不同识别策略进行分类的ATP荧光探针，包括与三磷酸部分的静电相互作用、与核碱基的-积相互作用,以及与糖附近的二醇结合等，为该领域的研究提供了详细且有益的参考。Tamima等构建的含有二口比咤配体的苯并香豆素染料的锌（11）复合物荧光探针18可以可逆地与ATP快速结合，特异性好。Sun等基于ATP氢键和罗丹明基团之间的-相互作用开发的一种双光子荧光探针19（图6）,可以通过与罗丹明衍生物的反应引起荧光变化实现对ATP的检测，检测范围为25mmolLzLOD为0.01mmolLo图6ATP结构.用于开发ATP探针的3种不同的相互作用及相应的探针2.6 气体一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）和硫化氢（H2S）是3种重要的气态神经递质，通过不同机制发挥相似的生物效应，如这3种气体均具备血管扩张作用，有助于促进血管生成和血管重塑，同时也具备抗炎以及消炎作用，荧光探针在探究这些神经递质的复杂作用方面表现出一定的潜力。目前关于NO荧光探针的设计途径主要包括利用过渡金属配合物的置换反应、芳香基团仲胺亚硝化反应、Hantzschester芳构化反应、形成Se-No键、芳香伯胺还原以及形成重氮环。Wang等合成了一种基于BODIPY的荧光探针20（图7）,可以定位在溶酶体中检测NOoHan等构建了比例荧光探针21对NO进行检测，纤维化肝脏的高粘性环境限制了分子内旋转，增强了荧光信号，使得荧光发生红色到橙色的转变。图7气体神经递质荧光探针结构CO荧光探针大多基于金属配合物，Liu等对利用金属配合物检测CO的荧光探针的相关研究进展进行了综述，主要介绍了两种不同的方法：一是金属配合物既用作CO荧光响应的受体，也用作信号单元；二是在CO存在下,金属配合物催化弱荧光发射的有机前体进行氢化竣化、城基化和叠氮城基化从而得到强荧光衍生物。针对H2S荧光探针的报道较多，本研究小组在H2S、SO2、多硫化氢(H2Sn,n>1)等生物体系内活性硫组分的代谢、成像以及信号传导方面进行了大量研究，其反应机制主要包括H2S的亲核加成、H2S对二硝基苯醛或其它离去基团的硫解、H2S介导的叠氮化物或硝基还原为胺、H2S置换铜沉淀。Li等详细介绍了亲核加成、还原、铜离子沉淀等多种检测H2S的方法。Zhao等和Quan等合成的基于BODIPY的荧光探针可实现H2S的快速响应。Chen等和Wang等将基于香豆素-半菁和花菁骨架的线粒体靶向荧光探针用于H2S检测。探针22通过将响应基团2-曝吩甲酰氯与菁染料荧光团相结合，利用H2S的亲核反应和相应单元的水解对H2S进行检测。3总结与展望本综述主要介绍了响应型荧光探针在神经递质检测领域的应用与研究进展。神经递质作为神经系统重要的信号传递分子，在神经科学和医学研究中具有重要作用。通过设计合理的荧光探针，可以实现对神经递质的高灵敏度、高选择性、高特异性检测，为研究神经递质的分布、释放、信号通路等提供强有力的工具。已有研究中针对不同类型的神经递质，包括胆碱类、生物胺类、氨基酸类、神经肽类以及气体，均有相应的荧光探针被开发，这些探针在体内外实验中展现出优异性能，有助于更深入地理解神经递质的功能和调控机制。然而，部分神经递质(如氨基酸)的结构和作用位点存在相似之处，需要实现更高水平的选择性和特异性；另一方面，疾病的发生往往涉及多种神经递质含量变化的复杂网络调节，开发出能够同时动态监测多种神经递质的探针，将在临床医学上具有重要意义。这促使新一代的探针向更加灵敏、特异、快速以及多功能的方向发展，并可能需要借助人工智能和机器学习帮助筛选有意义的信息，为神经递质研究提供更优秀的解法，发挥荧光探针在分子医学中的重要作用。本文引用来源:付信悦,张良伟,刘姝的等.响应型荧光探针检测神经递质的研究进展J.分析测试学报,2024,43(01).