SN_T5668-2023水禽圆环病毒感染检疫技术规范.docx

ICS 11.220CCS B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T56682023水禽圆环病毒感染检疫技术规范Technicalspecificationforcircovirusinfectioninwaterfowls2023-12-29发布2024-07-01实施中华人民共和国海关总署发布刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利o本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院畜牧兽医研究所、厦门市翰均科检测科技有限公司、中华人民共和国石家庄海关本文件主要起草人:郑腾、傅光华、张体银、施少华、张志灯、黄瑜、王武军、程龙飞、王建昌、谢向机、陈翠腾、黄素文、万春和、傅秋玲、姜柒陈红梅、刘荣昌、辘、江南松。水禽圆环病毒感染检疫技术规范1范围本文件规定了水禽圆环病毒感染的临床诊断、聚合酶链式反应检测和实时荧光聚合酶链式反应检测要求。本文件适用于水禽圆环病毒感染(鸭圆环病毒感染和鹅圆环病毒感染)的监测、检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。U:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(CyCIethresh。Id)DNA：脱氧核糖核酸(DeoXyribOnUdeiCaCid)dNTP：三磷酸脱氧核昔酸(DeOXynUCIeoSidetriPhoSPhate)DuCV:鸭圆环病毒(DUCkCircovirus)EB：漠化乙锭(EthidiUmbromide)GoCV:鹅圆环病毒(GooseCircovirus)PCR：聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)5疫病概述水禽圆环病毒感染是近年来倍受关注的新发现传染病之一，该病流行十分广泛，宿主谱广，不同品种、不同日龄的水禽均有报道，以生长迟缓、羽毛紊乱、体况消瘦为主要临床特征。水禽圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，基因组为单链环状DNA,主要包括鸭圆环病毒(DUCkCirCOVirus,DUCV)和鹅圆环病毒(GoosecircovirgGoCV)0该病毒主要侵害水禽的淋巴网状内皮组织，引起淋巴器官(特别是法氏囊)淋巴细胞减少，免疫力下降，导致宿主对其他病原(如大肠杆菌、巴氏杆菌或禽流感，鸭甲肝病毒及水禽细小病毒等)二次感染的易感性增加,影响其他疫病病原疫苗的免疫效果。G。CV最早于1999年在发病鹅中被发现QUCV于2003年首次在患病鸭中被发现。我国自2005年和2008年首次分别报道了GoCV和DUCV在水禽中出现以后，各地饲养的水禽均陆续出现感染报道。G。CV核酸阳性率达35.4%,种鹅群GOCV血清阳性率在60.0%90.9%,鸭群DUCV阳性率则在10%81.6%。值得关注的是，目前已有在患病鹅中检测到DUCV的报道，说明两种水禽圆环病毒还存在交叉感染现象。6临床诊断6.1 临床症状感染圆环病毒的水禽可以出现以下症状：a）水禽群体内个体间生长参差不齐，感染水禽体况消瘦，体重与同日龄未感染健康水禽差异明显；b）羽毛杂乱，易脱落，严重的出现背脊或翅尖羽毛完全脱落。6.2 病理变化6.2 .1剖检变化水禽感染圆环病毒一周以后主要免疫器官开始出现以下变化：a）胸腺出血或萎缩；b）法氏囊萎缩；c）脾脏萎缩。6.2.2组织学变化组织学变化如下：a）法氏囊淋巴滤泡结构消失，淋巴细胞显著减少；b）胸腺淋巴细胞显著减少，细胞核出现碎裂和空泡化；c）脾脏红髓和白髓边界消失，白髓淋巴细胞减少。6.3 初步诊断当水禽出现以上临床症状，结合病理变化,可初步诊断为疑似水禽圆环病毒感染，需要进一步进行实验室检测。7仪器和设备7.1 梯度PCR扩增仪。7.2 实时荧光PCR仪。7.3 台式冷冻离心机（转速不低于12000rmin）。7.4 微量移液器（0.5L10L,2L20L,20L-200L,100L-1000L）.7.5 组织匀浆器。7.6 电泳仪。7.7 电泳槽。7.8 紫外凝胶成像系统。7.9 冰箱（2。（：8。（：和-70。08试剂、引物和探针8.1水：符合GB/T6682中二级水的规格8.2 蛋白酶Ke8.3 10%十二烷基磺酸钠(SDS):配制方法按附录A中A.lo8.4 TriS饱和苯酚。8.5 酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24:1).8.6 3molL的醋酸钠溶液：配制方法按A.2。8.7 无水乙醇。8.8 75%乙醇:配制方法按A.3。8.9 漠化乙锭溶液：配制方法按A.4。8. 10IXTAE缓冲液：配制方法按A.5。8.111.0%琼脂糖凝胶：配制方法按A.6。8. 12DNA分子量标准物：100bp2000bp<.8.13IOX加样缓冲液：配制方法按A.7。8.14普通PCR引物:检测DUCV、GOCV共有上游引物F1：5'-AAYCWCGCGGGAAGTGGTGGGA-3'；检测DUCV的下游引物R1：5'-TTCTARGCATAAACGAGATC-3'；检测GOCV的下游引物R2：5'-ATAMGATTCGGACAATGGACTG-3,.引物序列中的简并碱基丫表示C或T1W表示A或T,M表示A或UR表示A或G,F1与Rl用于检测DUCV,扩增条带为554bp大小的基因片段，Fl与R2用于检测GoCV,扩增条带为407bp大小的基因片段。各引物的工作浓度均为10molL,保存于-20备用。8.15荧光PCR引物和探针。8.15.1检测鸭圆环病毒的SYBRGreenI荧光PCR检测引物：上游引物DUCV-F：5'-GGCGAAGAGCGGCAACTA-3'；下游引物DUCV-R：5'-CCGACGATAGCGAACTTGC-3、扩增片段约123bp,用水溶解至IOPmol/L后，保存于-20。C备用。8.15.2检测鹅圆环病毒荧光PCR检测引物和探针：上游引物GoCV-FrS1-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG-3'；下游引物GoCV-RS-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG-3'；探针为gocv-p：5'-acaAgccgargacacCGCAGCACC-3、引物序列中的简并碱基R表示A或G,探针G。CV-P其5末端标记荧光报告基团FAM,3末端标记荧光淬灭基团ECIiPSe,扩增片段约82bp,用水溶解至IoPmOI/L后，保存于-20备用。9样品的采集与处理对生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或发病的水禽,按NY/T541-2016的要求无菌采集水禽的法氏囊、脾脏等器官合并进行检测。采集的器官剪碎后与磷酸盐缓冲液(PBS,按A.8)按体积比1：5的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8000rmin离心30min,取上清，用于DNA抽提，或置-20。(：条件下冻存备用。对被检水禽，以棉拭子分别采集咽喉和泄殖腔分泌物合并进行检测。以无菌棉拭子在咽喉或泄殖腔内来回刮取3次后，合并放置于2mL含抗生素的磷酸盐缓冲液中，用于DNA抽提，或置-20°C赛存备用O若采集的样品需放置6h后再进行处理，应先置-20。（:条件下保存备用，应在冷冻状态下运输。10水禽圆环病毒聚合酶链式反应10.1 设立对照分别以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照。10.2 DNA的提取10.2 .1取540L匀浆上清液或棉拭子浸出液，加入60PLlO%的SDS,再加入蛋白酶K至终浓度5mgmL充分混匀15s,56水浴2h。10.2.2 加入等体积TriS饱和苯酚，充分混匀15s,4。C下12000rmin离心15min10.2.3 取离心后上清液加入等体积酚：三氯甲烷：异戊醵（25：24：1）,颠倒混匀15s,静置5min后，在4。C下12000Iymin离心15mino10.2.4 重复10.2.3步骤1次。10.2.5 取离心后的上清液加入1/10体积的3molL的醋酸钠溶液（PH为5.2）、2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀15s,-20。C沉淀2h10.2.6 随后在4OC下12000rmin离心15min轻轻倾去上清液,加入800L75%乙醇清洗沉淀2次，瞬时离心后，吸尽残余液体，室温静置5min10.2.7 加入50L水重悬，轻轻混匀溶解管壁上的DNA,冰上保存备用。提取的DNA应在2h内进行PCR扩增或保存于-20°C条件下。注：DNA提取也能选用等效的商品化试剂盒。10.3PCR反应操作10.3 .1PCR反应液配制在0.2mLPCR反应管中，按表1配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，充分混匀。表1水禽圆环病毒PCR反应体系（25L）组分加样量L终浓度IOXTaqDNA聚合酶PCR反应缓冲液2.51×MgSO4(50mmolL)0.5lmmolLdNTPs(10mmolLeach)0.50.2mmol/LTaqDNA聚合酹(5UL)0.50.1UL引物Fl(10molL)0.750.3moL引物Rl(10molL)0.50.2molL引物R2(10molL)0.50.2molL水17.25模板/对照2一10.3.2PCR反应步骤混匀后瞬时离心，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行PCR：95。C预热5min后，按以下循环参数循环：94°C30s,5330s,72Imin,循环35次;72°C延伸8min,反应结束后保存于410.4 琼脂糖凝胶电泳分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5L的PCR产物与0.5PL的IOX加样缓冲液混合均匀，分别加入1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中，同时在另一样孔中加5pLDNA分子量标准物；以5Vcm的电压电泳30min后，经紫外凝胶成像系统观察结果。10.5 凝胶成像分析和测序使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现407bp或554bp大小的扩增条带，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，参考序列见附录B中B.1（GoCV）和B.2（DuCV）10.6 结果判定10.6.2 试验成立条件当阳性对照样品中，G。CV样品出现407bp大小的扩增条带（见附录C电泳图2号泳道），DuCV样品出现554bp大小的扩增条带（见附录C电泳图3号泳道），空白对照样品和阴性对照样品均无特异性扩增条带（见附录C电泳图1号、4号泳道），本次试验结果有效。10.6.3 待检样品结果判定当待检样品出现407bp左右特异性条带（参见附录C电泳图7号泳道），所获扩增产物与参考序列（见B.1）同源性达到90%以上，可判样品为G。CV核酸阳性当待检样品出现554bp左右特异性条带（见附录C电泳图5、6号泳道），所获扩增产物与参考序列（见B.2）同源性达到80%以上，可判样品为DUCV核酸阳性。无特异性扩增条带（见附录C电泳图4号泳道），则判样品为水禽圆环病毒核酸阴性。11鸭圆环病毒实时荧光PCR11.1 设立对照以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照。11.2 DNA提取同10.2°11.3 实时荧光PCR扩增11.3.1 反应体系在0.2mLPCR反应管中，按表2配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，充分混匀。表2鸭圆环病毒实时荧光PCR反应体系(20L)组分加样量L终浓度SYBR1PremixExTaq11(2×)10IxDuCV-F(10molL)0.20.lmoLDuCV-R(10molL)0.20.lmoL水8.6模板/对照1一11.3.2 反应程序设定SYBRGreenl实时荧光PCR检测DUCV的反应参数。第一阶段，预变性950ClOmino第二阶段，95oClOsf60°C30s,40个循环；荧光信号的收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行，以获得样本的扩增动力学曲线O第三阶段，反应结束后先加热至95,然后再降至60,开始以0.5°Cs递增至95检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。11.4 结果判断综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30,在扩增产物的DNA熔解温度(Tm)=(80.55±0.18)。C时出现单一的特异性峰；阳性对照和空白对照无扩增曲线,而且Ct值>38或无Ct值，二者均成立才可判定试验成立°检验样本Ct值35,且在扩增产物DNA熔解温度(Tm)=(80.55±0.18)。C时出现单一的特异性峰,并且曲线有明显的对数增长期，报告DUCV核酸阳性；检验样本35<Ct值38时，且在Tm=(80.55±0.18)出现单一的特异性峰，重复一次，如果Ct值仍然438,并且曲线有明显的对数增长期,报告DUCV核酸阳性，否则报告DUCV核酸阴性；样本没有Ct值或Ct值>38时，报告未检出DUCV核酸。扩增区序列见B.3o12鹅圆环病毒实时荧光PCR12.1 设立对照以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阳性样品作为阴性对照。以水作为空白对照。12.2 DNA提取同10.2<>12.3 实时荧光PCR扩增12.3.1 反应体系在0.2mLPCR反应管中，按表3配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，充分混匀。表3鹅圆环病毒实时荧光PCR反应体系（20L）组分加样量L终浓度ProbeqPCRMi×(2×)10IxGoCV-F(10molL)0.20.lmoLGoCV-R(10molL)0.20.lmoLGoCV-p(10moL)0.40.2moL水8.2一模板/对照1一12.3.2 反应程序将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定：95。C预变性2min;之后95。C变性15s,65。C退火20s,收集荧光,共45个循环。同时设阳性、阻性对照和空白对照。12.4 结果判断综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阳性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析o阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30;阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值40或无Ct值，二者均成立才可判定试验成立。检验样本Ct值35时，报告G。CV核酸阳性；检验样本35Ct值40时，重复一次，如果U值仍然40,并且曲线有明显的对数增长期，报告G。CV核酸阳性，否则报告GoCV核酸阴性；样本无Ct值或U值40时，报告未检出GoCV核酸。扩增区序列见B.4o13综合判定13.1 临床判定为疑似病例，经PCR扩增出现407bp左右特异性条带，且经序列分析证明所获扩增产物与参考序歹IK见B.1）同源性达到90%以上的；或实时荧光PCR检测呈阳性的，可判定为GoCV感染。13.2 临床判定为疑似病例，经PCR扩增出现554bp左右特异性条带，且经序列分析证明所获扩增产物与参考序列（见B.2）同源性达到80%以上；或实时荧光PCR检测呈阳性的，可判定为DUCV感染。133临床判定为疑似病例，经PCR扩增出现407bp和554bp左右特异性条带，且经序列分析证明所获扩增产物分别与参考序列（见B.1）同源性达到90%以上的，或实时荧光PCR检测呈阳性的；以及与参考序歹IK见B.2）同源性达到80%以上，或实时荧光PCR检测呈阳性的；可判定为DuCVGoCV共感染。13.4 被检水禽虽没有明显的临床症状和剖检变化，但病原检测符合13.1中病原检测判定标准，可判样品为GoCV感染；病原检测符合13.2中病原检测判定标准，可判样品为DUcV感染。附录A（规范性）试剂的配制1.1 110%十二烷基磺酸钠（SDS）称取SDS100g置于100OmL烧杯中，加入水80OmL,68加热溶解，温度降至室温后滴加浓盐酸调节PH至7.2,再加水定容至100OmL,室温保存备用。A.23molL的醋酸钠溶液（NaOAe）称取40.8gNaOAc3H2加入水40mL搅拌溶解，用冰醋酸调节PH至5.2,加水定容至100mL经L034IO5Pa高压灭菌30min后常温保存备用。A.375%乙醇取无水乙醵75OmL加入水25OmL,定容至100OmL20保存备用。A.4澳化乙锭（EB）溶液取漠化乙锭20mg加水至20mLA.5IXTAE电泳缓冲液A.5.1配制0.5molL乙二铁四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）称取二水乙二筱四乙酸二钠18.6Ig溶解于适量水中，混匀后用10%氢氧化钠溶液调PH至8.0,最后加水至100mLA.5.2配制50×TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷（TriS）242g冰乙酸57.1mL0.5moL乙二铉四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL水至100OrnL用时用水稀释50倍后使用。A.5.3配制IXTAE电泳缓冲液取50XTAE电泳缓冲液20mL加水至100OmLA.61.0%琼脂糖凝胶取琼脂糖LOg加入IXTAE电泳缓冲液至IoomL,加热至完全融化后冷却至5（C60。C时，再加演化乙锭（EB）溶液5L,摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用0A.7IOX加样缓冲液聚蔗糖25g漠酚蓝0.Ig二甲苯青水0.1g至100mLA.80.01molL磷酸盐缓冲液（PBS）NaCIKCINa2HPO412H2OKH2PO48.0g0.2g2.9g0.2g将上述试剂溶于80OmL蒸耀水中，定容至100OmL,1.034Xi。'Pa高压灭菌30min,4OC保存备用。附录B（资料性）参考序列1.2 1PCR扩增的鹅圆环病毒基因序歹J（共407bp）AatctcgcgggaagtggtgggatggctataatgggcaggatgtggttgtgatggatgAtttttatgggtggctcccttacgatgaccttttaaggatctgtgatcgctatcctttacgGgttgagtataagggtggtatgacccagttcgtgtctaagacccttataattacttctaaTagggagcctcgcgattggtataaatgcgagtgtgatgtgtcggcattgtatcggagaatTaatcagtacctgatattaaccccggatggttatgcgcccgcccctgattttatgctgccgTtcccaataaactactagagacctggttaaggttagaataaggatcgtttattgtgtaaaAttacaataaagttatggtgcaagcccagtccattgtccgaatcttat1.3 PCR扩增的鸭圆环病毒基因序列（共554bp）AaccacgcgggaagtggtgggacggttactcgggaaatgacgtagtcgtcatggacgaCttttatggttggttgccttatgatgatttgctgagaattaccgaccgttaccctttacggGttgaatttaaaggcggtatgactcagtttgtggctaagaccttgatcataacaagtaacCgcgagcctcgtgattggtacaagagcgagtttgacctttcagctctgtaccgcagaattaAcaagtatcttgtgtataacattgacaagtacgaacccgcccaggcatgtaccctcccgttCccaataaactactgagaccaatttgccgtgagtcgtttattaaggtaaacacttggcagGgtattacacttgggcagctcggttaaggttaggcacttggcagggattaaacacttgggCagctcggttaaggttaggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggtTaggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggttagaacaagatctcgTttatgcttagaa1.4 实时荧光PCR扩增的鸭圆环病毒基因序列（基于鸭圆环病毒CaP蛋白基因，共123bp）GgcgaagagcggcaactactcatacaagaggtgggtctttaccattaataaccctaccTttgaagattatgttcatgttctagagttttgcacgctcgacaattgcaagttcgctatcGTCGG1.5 实时荧光PCR扩增的鹅圆环病毒基因序歹J（基于鹅圆环病毒CaP蛋白基因，共82bp）AggtaatggttgcttctattgtcagaggtgctgcggtgtcctcggcttgtcttagtgaCatacccattccgtagaataccac附录C（资料性）PCR检测结果电泳图例PCR检测结果电泳图例见图C.IebpMl2345678bp标引序号说明：M-DNA分子质量标准物；1 一空白对照样品扩增结果；2 -G。CV阳性样品犷增结果；3 -DUCV阳性样品扩增结果；4 一阴性样品扩增结果；5,6鸭源待检样品扩增结果；5 ,8一鹅源待检样品扩增结果.图C.1PCR检测结果电泳图