10 种植物精油对腐生葡萄球菌抑制效果比较及肉桂精油抑菌机制分析.docx

特定腐败菌（SSO）是海产品中的一类重要微生物，具有调节鱼体代谢产生一系列化合物与生物活性物质的能力。SSO还可能通过其初级或次级代谢，产生具有异味的挥发性有机化合物，直接影响鱼肉的感官特性、质地与新鲜度。因此,其作为评价化学腐败指数的重要部分，在货架期预测中起到关键作用。在对10种植物精油对腐生葡萄球菌作用性能分析的基础上，筛选出效果最佳的植物精油肉桂精油；以其为研究对象，通过分析其对腐生葡萄球菌的微生物生长曲线、碱性磷酸酶（AKP）活力、紫外吸收物质与扫描电子显微镜等综合评价，并结合其对菌体生物膜的抑制率分析，研究肉桂精油对腐生葡萄球菌的作用机制与生物被膜形成的影响，以期为植物精油等植物源生物保鲜剂在水产品保鲜中的应用提供理论参考。1、10种植物精油处理对腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）不同植物精油在抑菌活性上表现出较大差异，在10种受试植物精油中，以肉桂精油的作用效果最佳，其对腐生葡萄球菌的抑菌圈直径为（24.10±2.55）mm,MlC和MBC均为1mgmLo姜精油与甜茴香精油的抑菌性较弱，可能由于其中活性物质易挥发，使部分有效成分在培养基表面重新分配。植物精油大多含有酚类物质，如百里香酚、丁香酚与香芹酚等，并以此发挥抗菌作用。在肉桂精油中，肉桂醛为发挥其抑菌作用的主要成分。由MIC结果可知，肉桂精油在10种精油中的抑菌性最强，因此后期将以DMSO为对照组，1/2MIC、MIC、2MIC肉桂精油为处理组，进一步研究肉桂精油对腐生葡萄球菌的作用效果。2、肉桂精油处理对腐生葡萄球菌生长曲线的影响CK组菌体生长正常，随着时间延长，其菌落总数呈上升趋势，而不同质量浓度肉桂精油处理组作用效果明显，在2h内菌体数明显降低。其中，1/2MIC肉桂精油组菌体生长在14h时被完全抑制；MIC肉桂精油组与2MIC肉桂精油组在5h时被完全抑制，未有活菌检出。结果表明，肉桂精油对抑制腐生葡萄球菌生长有明显效果。3、肉桂精油处理对腐生葡萄球菌细胞膜完整性的影响随着处理时间的延长,不同质量浓度处理组在260nm和280nm波长处的吸光度总体呈上升趋势，表明肉桂精油对腐生葡萄球菌的作用效果具有一定的时间依赖性。其中，MlC组与2MIC肉桂精油处理组的吸光度相比于CK组上升迅速；其均在0.5h时升高，处理Ih后，吸光度达到最大，2MIC处理组的吸光度上升速度明显快于MIC处理组，由此表明肉桂精油对腐生葡萄球菌的细胞膜完整性有较强破坏性，其能使菌体胞内物质大量渗出，作用强度与质量浓度正相关。4、肉桂精油处理对腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影响经过不同质量浓度的肉桂精油处理5h后，CK组AKP活力无显著变化，各处理组的AKP活力均有所上升，AKP活力与肉桂精油质量浓度呈正相关，其中2MIC肉桂精油组增长最为明显，在培养5h时达6.52UmLo表明肉桂精油对腐生葡萄球菌的细胞壁有破坏作用，同时还可能使细胞膜遭到破坏，胞内重要生理物质泄漏，最终导致细菌死亡。5、肉桂精油处理对腐生葡萄球菌微观结构的影响在CK组中，菌体保持原有完整的球状结构，菌体表面致密、光滑而饱满；而经不同质量浓度的肉桂精油处理后，菌体表面出现明显皱缩，部分菌体表面不再致密，出现溶解与黏聚现象。同时，经MIC与2MIC肉桂精油处理后，部分菌体已破裂并有内容物流出，表明肉桂精油对腐生葡萄球菌的菌体细胞壁与细胞膜结构破坏作用明显，使细胞膜受到不同程度的损伤，胞内物质泄漏，最终导致菌体死亡。6、肉桂精油处理对腐生葡萄球菌生物膜形成的影响不同质量浓度的肉桂精油对腐生葡萄球菌生物膜的生长有明显抑制作用，表明其对腐生葡萄球菌生物膜具有良好的清除效果，且抑制效果随着肉桂精油质量浓度的升高而增强。生物膜的形成机制较复杂，通常认为受到胞间通讯系统在不同菌种间差异的影响，其常见的信号调节分子有脂肪酰基高丝氨酸内酯（AHLs）、自诱导肽（AIP）与自诱导分子-2（AI-2）等。讨论通过比较10种植物精油对腐生葡萄球菌的抗菌作用，并以抗菌作用最明显的肉桂精油为研究对象，初步探究其对腐生葡萄球菌的作用机制。结果表明，肉桂精油对腐生葡萄球菌的MIC与MBC均为1mg/mL；经肉桂精油处理后，腐生葡萄球菌生长明显延缓，细胞膜通透性增加，其菌体完整性受到破坏，并对其生物膜的生成有明显的抑制作用。附参考资料植物精油抗细菌的作用机制根据精油的化学特性、渗透性和细菌细胞膜的破坏，抗菌作用模式导致细菌感染控制过程中离子稳态和电子传递链等关键功能的丧失（IJo此外，精油通过抑制细菌的蛋白质合成来阻止细菌细胞分裂。基于现有的研究报告，抑制机制可概括为“细菌细胞壁膜裂解、抗性质粒丧失和群体感应丧失”（如下图所示）。茶树精油作为膜渗透剂，导致细菌失去化学渗透控制【2-3】。精油的酚/单菇成分的极性使其很容易与细菌细胞壁成分发生作用，具有穿透细菌细胞壁的天然渗透性4o精油的疏水性可以破坏细菌的细胞膜5-7L此外，百里香酚、香芹酚和丁香酚等酚类化合物可以分解饱和脂肪酸，阻碍细菌细胞分裂【8-9。在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制过程中，牛至精油和肉桂精油被发现在胞质周围形成大而不规则的空隙以及胞质内修饰6L同样，在较低剂量下，月桂烯也会破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，细胞质成分聚集使细胞壁更致密10-1Ilo细菌细胞分裂的关键蛋白是细胞质FtsZ(丝状温度敏感突变体Z),FtsZ是细菌细胞分裂所必需的。通常，FtSZ通过在细胞分裂位点形成Z形环来调节细菌细胞分裂过程。肉桂醛能够减少大肠杆菌中FtsZ的组装、GTP(三磷酸鸟甘)依赖性聚合和GTP水解【12。精油还能够破坏细菌细胞膜，改变细胞内生化网络，降低细胞ATP浓度I3-15L细菌的质子动力在K+和H+离子之间的平衡中起着至关重要的作用，丁香酚、肉桂醛和香芹酚在5至30M的浓度范围内影响这一平衡从而抑制葡萄糖释放ATP,导致细菌细胞死亡116】。作为细菌群落内复杂信号网络的一部分，群体感应(QUOnImsensing,QS)导致生物膜的形成，以抵抗抗生素【17】。丁香、天竺葵、薰衣草、玫瑰和迷迭香精油能抑制含有假单胞菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和乳杆菌的生物膜【18-19。肉桂醛及其衍生物在浓度为60-100UM时，可降低哈威弧菌BB886、鳗弧菌和创伤弧菌的毒力因子LuxR的DNA结合能力20-22】。单菇烯作为最丰富的精油成分之一，抗菌作用靶标包括膜嵌入蛋白、膜流动渗透性和离子转运过程【23】。1 ENazzaro,EFratianni,L.DeMartino,R.Coppola,V.DeFeo,Effectofessentialoilsonpathogenicbacteria,Pharmaceuticals6(2013)1451-1474.2 S.Burt,Essentialoils:theirantibacterialpropertiesandpotentialapplicationsinfoods-areview,Int.J.Food.Microbiol.94(2004)223-253.3 R.Hamoud,ESporer,J.Reichling,M.Wink,Antimicrobialactivityofatraditionallyusedcomplexessentialoildistillate(Olbas(R)Tropfen)incomparisontoitsindividualessentialoilingredients,Phytomedicine19(2012)969-976.4 S.Hemaiswarya,M.Doble,SynergisticinteractionofeugenolwithantibioticsagainstGramnegativebacteria,Phytomedicine16(2009)997-1005.5 A.O.Gill,R.A.Holley,DisruptionofEscherichiacoli,ListeriamonocytogenesandLactobacillussakeicellularmembranesbyplantoilaromatics,Int.J.Food.Microbiol108(2006)1-9.6 R.Becerril,R.Go'mez-Lus,P.Goni,P.Lo,pez,Combinationofanalyticalandmicrobiologicaltechniquestostudytheantimicrobialactivityofanewactivefoodpackagingcontainingcinnamonoror'eganoagainstE.coliandS.aureus,Analytic.Bioanalytical.Chem.388(2007)1003-1011.7 V.N.Lima,C.D.Oliveira-Tintino,E.S.Santos,L.P.Morais,S.R.Tintino,T.S.Freitas,etal.,Antimicrobialandenhancementoftheantibioticactivitybyphenoliccompounds:Gallicacid,caffeicacidandpyrogallol,Microb.Pathogen.99(2016)56-61.8 D.J.Fitzgerald,M.Stratford,M.J.Gasson,J.Ueckert,A.Bos,A.Narbad,ModeofantimicrobialactionofvanillinagainstEscherichiacoli,LactobacillusplantarumandListeriainnocua,J.AppLMicrobiol.97(2004)104-113.9 R.DiPasqua,G.Betts,N.Hoskins,M.Edwards,D.Ercolini,GMauriello,Membranetoxicityofantimicrobialcompoundsfromessentialoils,J.Agric.Food.Chem.55(2007)4863T870.10 I.Rasooli,M.B.Rezaei,A.Allameli,UltrastructuralstudiesonantimicrobialefficacyofthymeessentialoilsonListeriamonocytogenes,Int.J.Infect.Dis.10(2006)236-241.11 E.Guinoiseau,A.Luciani,PGRossi,Y.Quilichini,S.Ternengo,P.Bradesi,L.Berti,CellulareffectsinducedbyInulagraveolensandSantolinaCorsicaessentialoilsonStaphylococcusaureus,Eu.J.Clinic.Microbiol.Infect.Dis.29(2010)873-879.12 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M.Hyldgaard,T.Mygind,R.L.Meyer,Essentialoilsinfoodpreservation:modeofaction,synergies,andinteractionswithfoodmatrixcomponents,Front.Microbiol.3(2012)12植物精油的抑菌活性研究植物精油(essentialoils),又称挥发油，香精油和芳香油，是存在于芳香植物体内的一类具有挥发性、由分子量较小且具有一定活性的简单化合物组成、可随着水蒸气蒸僧、与水不能相互混溶的次生代谢物。具有强烈的香味和气味的油状液体物质的总称。植物精油的抑菌活性植物精油以其显著的抑菌活性和广泛的抗菌谱范围，以及与化学抑菌剂相比副作用和残留毒性小的独特优势，近年来在抑菌研究方面得到了广泛的关注。国内外出现了大量的关于精油抑菌活性的报道。国内外研究表明，天然植物精油对日常生产生活中的致病菌有很好的抑制作用。如薰衣草精油对单核细胞增多性李斯特菌、沙门氏菌等常见的食物传播:性致病菌有很强的抑菌活性。TASSOn和Nychas年报道了薄荷精油对肠炎沙门氏菌和单核细胞增多性李斯特单核细胞菌具有抑制作用。其后又通过对抑菌范围的测定，发现从长豆角核中提取的酚类物质以及从乳香胶中提取的精油，可以在食品中起到抑菌作用。吴传茂等研究发现，丁香精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、酵母、黑曲霉、青霉等食品常见污染菌有广谱抑菌作用。荔枝种仁精油、紫苏油、肉桂油、枝叶油、芥子油、桂皮油、茴香油、茴芹油、胡椒油以及从月桂、肉桂、大蒜、洋葱、阿魏胶、众香子、白莒蒲、高良姜等植物中提取的芳香精油，都具有一定的抑菌作用。从生姜、大蒜、葱、胡椒、肉豆蔻、茴香等香辛料中提取的香精油，对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、副溶血弧菌、黄曲霉菌等微生物有显著的抑制作用;丁香精油、大蒜精油对大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、绿脓杆菌都有较大的杀菌作用。植物精油的抑菌有效成分植物精油的化学成分组成十分复杂，经GC/MS分析,通常有几十至上百种化合物。经研究表明，在这些大量的精油成分中，小分子的酚类物质、菇烯类物质和醛酮类物质是主要的抑菌有效成分。此外，醇类，酸类和煌类物质也具有一定的抑菌活性。因此,植物精油的抑菌活性是各成分抑菌效果的综合体现。以下是几种精油抑菌成分的简单介绍：(1)香芹酚(CarVaerol)香芹酚是无色或淡黄色的油状液体，是牛至精油的主要成分之一。MohamedHazzit等人研究了生长在非洲南部的牛至精油的化学组成，发现香芹酚的含量为29.7%,这种精油对除李斯特氏菌外的所有受试菌种都有很好的抑制效果。胡艳芬等人测定了香芹酚单体对常见的病原菌(大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌)及益生菌(保加利亚乳杆菌和枯草芽抱杆菌)的抑制效果，结果证实在一定的药物浓度下香芹酚能够杀灭常见的病原菌，并且对肠道益生菌也有一定的抑制效果。(2)T香酚(EUgenO)丁香酚为无色或淡黄色液体，有强烈的丁香香气，是丁香精油的主要成分。楼兴隆等人对丁香精油进行了化学成分分析，发现丁香酚的含量高达97.29%o随后，他们又研究了丁香酚单体对番茄黑霉、白菜黑斑病菌、玉米大斑病菌、小麦纹枯病菌和葡萄炭疽病菌的抑菌作用，发现均有较好的抑制效果。吕世明等研究了丁香酚的体外抑菌活性,结果发现丁香酚对12种供试细菌具有广谱抗菌性，其中对大肠杆菌的作用最为明显,其最小抑菌浓度(MlC)为5ugmLo(3)百里香酚(ThymOl)百里香酚又称麝香草酚，与香芹酚是同分异构体，可以从百里香精油和牛至精油中提取，具有宜人香气和很强的杀菌作用。张静等人研窕了百里香酚对植物病原真菌的体外抗菌作用，发现百里香酚能够很好地抑制10种植物病原菌的生长，尤其对番茄灰霉病菌有明显的抑制效果。(4)柠檬烯(LimOnene)柠檬烯是为无色油状液体，有类似柠檬的香味。王雪梅等人采用琼脂扩散法和MIC法研究了柠檬烯单体的抑菌活性，结果显示柠檬烯单体在较宽的PH范围内具有广谱抗菌性，对6种供试菌种都有明显的抑制效果，并且对面包酵母、啤酒酵母和黑曲霉的抑制作用强于化学防腐剂(苯甲酸钠和山梨酸钾)。(5)肉桂醛(CinnamaIdehyde)肉桂醛是一种醛类有机化合物，为黄色黏稠状液体，大量存在于肉桂等植物体内。自然界中天然存在的肉桂醛均为反式结构。李京晶等人通过GC/MS分析肉桂精油的成分，发现肉桂醛的含量高达86.8%,并且肉桂醛单体对5株食品中常见污染菌的抗菌作用均强于化学防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾。最近有日本学者研究发现肉桂醛对真菌有明显的抑制作用，其作用方式是降解真菌的细胞壁,使其可以进入真菌菌体细胞内，继而损坏细胞器而起到抑菌效果。参考文献：1 .植物精油的抑菌评价及其应用-李凤清2 .天然植物精油的抑菌活性及其作用机理新研究-吕飞