短链脂肪酸在动物样本中的检测方法研究进展.docx

短链脂肪酸在动物样本中的检测方法研究进展刘娜焦京琳饶正华（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室,北京100193）短链脂肪酸（Short-Chainfattyacids,SCFAs）,又称挥发性脂肪酸（volatilefattyacids,VFA）,是肠道内未消化的复合碳水化合物被结肠厌氧微生物发酵的主要代谢终产物LlL其由碳链为1-6的有机竣酸构成，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等，SCFAS可降低畜禽胃肠道内容物的PH值，抑制病原菌的生长，同时促进养分的吸收:2L通常情况下，动物的SCFAS来源有两个方面，一是直接通过外源获取，二是通过后肠微生物的发酵产生，后者也是动物获取SCFAS的主要方式3。SCFAS作为营养物质通过瘤胃或肠道上皮细胞被吸收，为反刍动物提供大部分代谢能量需求4。在瘤胃液内的含量高达90-150mmolL,其中约80%的SCFAs在反刍动物瘤胃和网胃内被吸收，剩余的SCFAs主要在瓣胃和皱胃吸收:5L对非反刍动物来说，SCFAS主要是膳食纤维通过微生物在结肠（猪）或盲肠（禽）发酵合成，是肠道上皮细胞的主要能量物质，为其提供60%-70%的能量需求,是维持动物肠道健康的重要物质6。SCFAS可维持动物肠道内环境稳杰，促进肠道的消化吸收，激活肠道免疫应答，调节细胞分化与凋亡，调节机体的脂质代谢及糖代谢7。在动物健康和饲料营养研究中短链脂肪酸的浓度越来越受到关注，因此SCFAs的检测方法凸显尤为重要。动物样本和人体样本不尽相同。目前更多的检测方法是应用在人体粪便中，而关注动物样本检测方法优化的研究略少。SCFAS是一类半衰期短、代谢快的挥发性化合物。不同的生物样本中SCFAs的前处理方法不同，粪便中前处理常见有蒸储法、高速离心法及超滤法等；常用检测方法包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等。本文综述了近几年来不同动物样本中SCFAs检测主流的前处理和仪器分析方法，对比各方法的利弊，以期为SCFAS在动物样本中检测提供理论参考。1前处理1.1不同动物样本前处理方法1.1.1动物粪便样本由于肠道中SCFAS的组成与宿主肠道菌群直接关联，所以动物肠道菌群的研究中常常检测动物的粪便样本L8-91oSCFAs具有自身极性大、挥发性强、水溶性大的特点使样本快速处理尤为重要，常规的蒸偏、衍生化、萃取等方法耗时、耗有机试剂、污染大，因此在分离效果好的基础上需要简单、准确且快速直接的前处理方法口0,动物粪便样本的前处理方式较人体样本相对简单。在养殖场采集新鲜粪便后用低温转运箱运送到实验室进行检测，同时可备份样品在-80。C下冷冻保存。一般动物粪便样本前处理包括提取和低温高速离心，随后取上清液过膜进样。提取时可以采用蒸储水或盐酸溶液，其中盐酸可以用5%浓度Lll1或0,设浓度12等；蒸储水可以与样本量等体积L13-15,可以8倍体积16T7等，然后超声20mino蒋恺憧等1比较了酸（盐酸溶液，PH2）提取法和水（灭菌去离子水）提取法对于犊牛和小鼠的新鲜粪便中SCFAs的测定，结果表明2种方法均可检测到6种SCFAs,且水提法的SCFAs检测浓度高于酸提法，但无显著性差异。样本提取后一般采用4。C高速（离心力10000Xg以上）离心至少10min后取上清液待测。1.1.2动物肠道样本乙酸、丙酸和丁酸在猪的结肠短链脂肪酸中占据85%甚至更高的比例18-191o动物肠道内SCFAS的浓度主要取决于动物肠道内微生物群组成、饲粮中纤维的含量、饲料在肠道内的消化时间以及宿主与微生物的代谢通量。研究表明饲粮纤维水平可通过调节肠道微生物从而显著影响宿主的肠道健康，而这一过程可能源于纤维在后肠发酵产生SCFAS模式和浓度的差异20。不同纤维来源非淀粉多糖也会改变动物肠道中短链脂肪酸的种类和数量。Pieper等21在仔猪日粮中添加了麦秋和甜菜碱，发现猪结肠中乙酸的比例从58%增至62.7%,丙酸比例从25.7%降至23%。因此，研究学者常常通过动物肠道中短链脂肪酸的浓度变化来开展饲料营养与动物健康方面的研究。动物肠道样本在前处理过程中常用水提取。研究学者发现猪回肠食糜可以采用等体积双蒸水提取22,肉鸡盲肠食糜可以用两倍体积生理盐水提取23,肉兔盲肠内容物采用蒸僧水稀释10倍提取24,白鹅盲肠（半固体状）采用两倍体积蒸储水稀释提取25。提取后进行低温高速离心，再加入25%偏磷酸（也可以是25%偏磷酸-巴豆酸）溶液混匀，随后可以-20。C冰箱中过夜，也可以在冰水浴中放置半小时以上，最后低温高速离心去除蛋白质沉淀物，取上清液过膜进样。1.1.3动物瘤胃样本反刍动物为复胃动物，其中瘤胃是最大的胃，掌握反刍动物瘤胃中短链脂肪酸浓度对监测动物身体状况、调整营养水平、提高动物机体免疫力等具有重要意义26。瘤胃液的采集一般是用胃管式瘤胃采样器，采集后装于冻存管中并迅速置入液氮罐中冷冻，再带回实验室-80。C保存。研究学者在处理牛和羊的瘤胃液样本时前处理操作相对简单。离心可以清除瘤胃液中的颗粒物，牛瘤胃液可以先低速（6000×g）离心10min后再取上清液继续高速（14000×g）离心10min27,也可以直接高速（20000×g）离心25min取上清液28或16100Xg下离心30min取上清液29。羊的瘤胃液同样可以先低速（转速5400rmin）离心10min取上清液30。离心后的上清液均需要加25%偏磷酸混匀后再次低温高速离心后取上清液待测31-33。目前瘤胃液中短链脂肪酸也有团体标准T/NAIA005-2022»可以参考，同样用25%偏磷酸除去可溶性蛋白质后IoOOor/min离心10min后上清液过膜直接进样。1.2 内标物的选择在短链脂肪酸含量测定时常使用内标化合物。用内标法测定时需在样品中加入一种物质作内标，而内标物应符合以下条件：（1）应是样品中不存在的纯物质；（2）内标物质的色谱峰位置，应位于被测组分色谱峰附近或在几个被测组分色谱峰中间，且与这些组分能完全分离;（3）其物理性质及理化性质应与被测组分相近；（4）加入的量应与被测组分含量接近L34-35因此根据内标物的选择原则并结合实验室已有物质，短链脂肪酸测定时可选用异己酸27、4-甲基戊酸28、巴豆酸及丙二酸30、2-乙基丁酸（2EB）31-332-甲基丁酸36等为内标物质。1.3 同位素示踪法动物大肠中发酵产生的部分短链脂肪酸在肠道被吸收，供机体利用，而未被吸收利用的则随着大肠内容物以粪便的形式排出体外37,因此有学者关注短链脂肪酸在动物体内的去向研究，常利用同位素示踪法测定短链脂肪酸。同位素示踪剂对动物灌注常采用13C标记。Markantonatos等38将13C-乙酸钠盐、13C-丙酸钠盐和13C-丁酸钠盐注入荷斯坦母牛瘤胃中进行短链脂肪酸测定，瘤胃液前处理时同样加入偏磷酸后低温高速离心。张博等37利用13CTFA（乙酸、丙酸、丁酸）稳定性同位素灌注法，跟踪猪大肠内产生的VFA的去向，前处理时将大肠肠道组织用液氮研磨，随后用超纯水溶解并稀释，超声提取，随后高速离心取上清液待测。1.4衍生化法衍生化是将一些难于分析检测的物质转化为稳定且易于分析的物质。羚基的极性比较强，在气相色谱柱中易产生吸附从而使结果的重现性差，尤其在浓度低（