《包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法》编制说明.docx

安徽省地方标准编制说明标准名称包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法任务来源（项目计划号）2022-3-76第一起草单位（盖章）安徽省产品质量监督检验研究院单位地址合肥市包河工业园延安路13号参与起草单位安徽省食品药品检验研究院、安徽蓝蓝矿泉水有限公司标准起草人（全部起草人，应与标准文本前言中起草人排序一致）序号姓名单位职务职称电话编制情况1、编制过程简介2022年10月31日，收到安徽省市场监督管理局关于下达2022年第三批安徽省地方标准制修订计划的通知后,成立标准编制小组，成员有XXXXX。标准起草过程：2022年7月，安徽省产品质量监督检验研究院等单位向安徽省市场监督管理局提出包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法地方标准的制定申请。2022年10月，包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法被批准立项，随后成立标准编制小组。编制小组制定了标准编制工作计划、编写大纲，明确任务分工及各阶段进度时间。标准编制小组在充分收集、认真研究了相关标准及文献资料的基础上，结合实验室的条件和本方法的技术特点，对包装饮用水中铜绿假单胞菌进行了快速检测试验，在论证了PCR检测方法扩增体系的优化、快速检测试纸条的条件优化、灵敏度试验、特异性试验等前提下，通过反复研究和分析，建立了包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法。于2023年9月编写完成了地方标准包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法的征求意见稿初稿。2023年11月，在前期调研和对相关政策文件研究的基础上，参考相关标准内容，并经多次征询相关专家的意见对标准初稿进行了修改完善，形成最终的征求意见稿。2、制定标准的必要性和意义铜绿假单胞菌，又名绿脓杆菌，是一种条件致病菌，最适生长温度为35,广泛存在于水、土壤、空气、人和动物机体皮肤及肠道中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境有较强的抵抗力，其主要产生胞外酶、内毒素、外毒素A等十余种致病因子，可引起化脓性感染、菌血症、急性肠道疾病和皮肤炎症等。潮湿的环境是铜绿假单胞菌存在的重要条件，因此常见有包装饮用水铜绿假单胞菌不合格信息发布。近年来在安徽省食品安全监督抽检中包装饮用水的铜绿假单胞菌不合格率一直居高不下，其中2021年安徽省食品安全监督抽检桶装饮用水铜绿假单胞菌不合格率更是达到30%,占当年全部桶装饮用水不合格样品的80%,铜绿假单胞菌污染是桶装饮用水食品安全的主要问题。目前我国现行的包装饮用水中铜绿假单胞菌检验标准为GB8538-2022食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法，该标准方法为常规的滤膜过滤培养法，前处理复杂、实验室硬件要求高、试剂耗材消耗大、检测周期长。此外现有的铜绿假单胞菌检验方法还有分子生物学方法等。但这些方法都有仪器价格昂贵、试剂耗材消耗大、操作专业性要求高、检测周期长等缺点，已远远不能满足当前包装饮用水中铜绿假单胞菌的简洁、快速、大批量、低成本的需求，因此快速检测方法的建立迫在眉睫。本标准建立的包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法能将检测周期从2到5天缩短至40分钟,操作简便无需培养、试剂耗材消耗量小。该方法建立后，将大大提高市场监管和检测效率，将质量管控应用于生产、运输、储存、使用等各个领域，进一步完善包装饮用水中致病菌检测的标准体系，为食品安全监管提供支撑力量。3、制定标准的原则和依据，与现行法律法规、标准的关系编制原则：本标准在制定过程中，遵循“统一性、协调性、适用性、一致性、规范性”原则，注重标准的先进性和可操作性。按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则的相关规定进行编写，在术语定义、结构版式以及单位符号等方面保持一致性。另在编制过程中：符合相关法律法规、现行国家标准和技术法规的要求；符合食品安全法、国家相关食品的安全标准要求。编制依据：1.相关的政策法规：中华人民共和国标准化法、安徽省地方标准管理办法（皖市监发（2019）32号）、地方标准制修订工作指南（DB34T28002020）等。2.相关标准：GB8538-2022食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法、SN"5228.9-2019出口食品中病原微生物快速筛选方法MALDI-TOfMS第9部分：铜绿假单胞菌、DB64/T1682-2019包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法、T/SDAQI007-2021生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测实时荧光PCR方法、T/HBFIA0026-2021包装饮用水中铜绿假单胞菌的测定陶底物法等。本标准符合现行法律、法规和强制性标准的规定。4、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述(详细说明)主要条款：本标准的章节由：范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂或材料、仪器和设备、分析步骤、质控试验、结果分析、性能指标组成。其中“分析步骤”、“质控试验”和“结果分析”是本标准的主要技术内容。本标准适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测。主要技术指标、参数：1、分析步骤(1)水样过滤将25OmL水样通过孔径0.45m的滤膜过滤，滤膜备用。(2) DNA提取将上述步骤的得到的滤膜置于无菌玻璃瓶底部，加入1mL的TE缓冲溶液重悬，再将玻璃瓶置于超声仪中超声8min,尽可能取玻璃瓶中的全部溶液到1.5mL离心管中，50OOrPm离心5min,取上清液至新的1.5mL离心管，舍弃沉淀，上清即为含有铜绿假单胞菌的DNA的溶液。(3) PCR扩增反应PCR扩增体系包括TaqPCRMaSterMiX25L,上下游引物各0.8L(10molL),DNA模板2L,ddH208.9LoPCR扩增条件为：95预变性51!1皿；94变性30s,61退火30s,72延伸30s,共35个循环；72再延伸2min。反应结束后取5L扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳中，观察扩增条带。取5L扩增产物琼脂糖电泳，观察扩增条带，产物用于侧向免疫层析检测。剩余PCR产物于4C保存备用。(4)测定取2L扩增后产物，滴加在样品垫上，随后滴加48L上样液于样品垫上，通过层析作用，上样液会流向C、T线，静置3min,观察C线及T线的出现情况，观察显色情况，进行结果判定。2、质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验。(1)空白试验取空白试样，按照分析步骤同法操作。（2）阳性质控试验准确量取空白试样250mL,加入适量铜绿假单胞菌菌悬液，使待测液中铜绿假单胞菌的终浓度为1x105CFU/mL,按照7的步骤同法操作。3、结果分析（1）通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。判定示意图见图1。无效：控制线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示检测结果无效。阴性：控制线（C线）显色，检测线（T线）不显色，判定为阴性。阳性：控制线（C线）与检测线（T线）均显色，判定为阳性。（2）质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，阳性质控试验测定结果应为阳性。否则表示不满足质控试验要求，此批样品结果无效。试验验证的论述：1、PCR检测方法扩增体系的优化引物量、退火温度、循环数是PCR扩增中的重要影响因素。引物量偏低导致扩增效率低，偏高易产生二聚体对侧向层析免疫结果产生影响；最优退火温度以保证引物同目标序列有效退火，减少非特异性结合；循环数的多少影响PCR反应的灵敏度、特异性、扩增效率等。经优化，选取最终扩增条件为:25L体系、mix12.5L上游引物0.8pL、下游引物0.8L35cycles,经优化，PCR扩增的检测灵敏度为IO1CFU/250mLo2、快速检测试纸条的条件优化在金标抗体的制备过程中，K2CO3溶液添加量会影响溶液的pH,进而影响胶体金与抗体的偶联效果。如图3a所示，K2CO3溶液添加量为8L时，T线颜色最深，增加K2CO3溶液添加量，T线的颜色逐渐变浅。因此选取8L为K2CO3的最佳添加量。抗体的添加量会影响方法的灵敏度和检测限，抗体添加量越少灵敏度越高，在保证C线、T线出线情况一致的前提下降低抗体的添加量，不仅可以提高灵敏度，而且还可以节约成本。结果如图3b所示，抗体量添加量为6L时，侧向层析免疫试纸条的T线显色效果较好，且随浓度增高并没有显色的明显加深，因此选择抗体的添加量为6L0封闭液中的蛋白可以与胶体金表面上的空白位置结合，以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在胶体金上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免非特异性结合，这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。图3c所示，分别为HAS、BSA、Casein>Na-Casein>重悬D,其中BSA及重悬D的出线颜色较深，但重悬D的背景颜色较深，因此选用BSA作为封闭液。不同的蛋白质溶液作为重悬液它可以产生不同的效果，合适的重悬液可以减少检测过程中的非特异性吸附，大大降低出现假阳的可能性。图3d中比较了HAS、重悬D、重悬E、Casein,Na-CaSein五种不同蛋白质重悬后的显线效果，可知重悬E重悬的金-抗体偶合物有更好的显线，且用重悬E复溶可以减少显色过程的非特异性吸附，对后续实验的进行尤为重要。上样缓冲溶液也是T线显线的关键点，本文主要从金标垫的释放、有无假阳以及出线时间的长短几个方面考察上样缓冲液的优劣。图3e是五种缓冲溶液结果对比图，分别是IOmMPB、1×PBSPBST、IOmMTris-HCkRunningBuffer,从图中可知同等条件下RimningBUffer的效果最好，虽然PBST缓冲液也可以达到很好的出线效果，但其溶液中含有表面活性剂，影响胶体金的释放速度，达到预期效果需要更长的时间，因此不适用于现场检测。综合考虑，选择了RUnningBUffer溶液作为上样缓冲溶液。NC膜（硝酸纤维素膜）与蛋白的结合是彼此之间疏水作用力、氢键以及静电吸力三者共同作用的结果。蛋白与膜结合能力的强弱将直接影响检测灵敏度和C/T线的宽度。选择合适的NC膜对检测结果有重要的影响。结果如图f所示，分别使用SNI2、JN140、YNlOO三种硝酸纤维素膜进行比较，YN100的效果较好，条带较粗较亮。因此，选用YNI（X）作为NC膜。注：图a：K2CO3添加量的优化（4、6、8、10、12L）；图b：FlTC添加量的优化（4、6、8、10、12L）；图c：封闭液优化（HAS、BSA、Casein>Na-CaSein、重悬D）；图d：重悬液优化（HAS、重悬D、重悬E、Casein,Na-Casein）；图e：上样液优化（10mMPB、IxPBS、PBST>10mMTris-HCkRunningBuffer）；图f：NC膜优化（SNI2、JNI40、YN100）图2侧向层析免疫试纸条优化3、灵敏度试验对定值为106cFU250mL铜绿假单胞菌用无菌生理盐水系列稀释为IO4CFU/250mLsIO3CFU/250mL、IO?cFU/250mL、IOICFU/250mL、10°CFU250mL进行测定，以不含铜绿假单胞菌的样品缓冲液为空白对照。3a图为侧向层析免疫试纸条检测及其电泳的结果图，展现了不同浓度铜绿假单胞菌的检测趋势，可以看到随着铜绿假单胞菌浓度的降低，琼脂糖凝胶电泳条带逐渐变浅，T线的颜色变得越来越浅，根据结果来看，琼脂糖凝胶电泳的检测灵敏度最低可以达到IOICFU250mL,侧向层析免疫试纸的检测灵敏度最低可达到1CFU250mL;图3a下方的峰值图是借助ImageJ软件测定的灰度值，可以看到峰值对T线的显色有很好的对应关系；图b是根据峰面积的测定值与铜绿假单胞菌的浓度做出的线性关系图，铜绿假单胞菌的浓度处于l-IOilCFU25OmL之间时，其检测结果呈现良好的线性关系。<< n%ctt<i>moa% "Hns（八 ASmI图3灵敏度检测结果4、快速检测试纸条的特异性图4是针对以上最优条件做的特异性验证、试纸条从左到右依次为阴性对照及浓度为IO6CFU250mL的大肠杆菌、金黄葡萄球菌、尿伤寒沙门氏菌、枯草芽他杆菌、荧光假单胞菌、浓度为CFU250mL的铜绿假单胞菌。结果如图所示，除目标铜绿假单胞菌外，其余对照菌的侧向层析免疫试无信号相应，表示该方法的特异性良好。图4胶体金免疫层析试纸条的特异性检测结果5、标准中如果涉及专利，应有明确的知识产权说明标准技术内容来自本项目成员试验结果和公开发表的论文，不会涉及专利等知识产权保护。6、采用国际标准或国外先进标准的，说明采标程度，以及国内外同类标准水平的对比情况本标准没有采用国际标准。本标准制定过程中未查到同类国内外标准。7、重大分歧意见的处理经过和依据暂无分歧意见。8、贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法、实施日期等）该标准对包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测技术研究,能用于各环节中包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测，建议尽快发布实施。9、废止现行相关标准的建议无。10、其它应予说明的事项无。注：没有的请填写“无”。