《包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法》征求意见稿.docx
DB34安徽省地方标准DB34/XXXXX-XXXX包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwaterColloidalgoldimmunochromatographyassay点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX -XX-XX 实施XXXX-XX-XX发布安徽省市场监督管理局发布刖5本文件按照GB/TL1-2020标准化工作导则笫1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省产品质量监督检验研究院提出。本文件由安徽省市场监督管理局归口。本文件起草单位：安徽省产品质量监督检验研究院、安徽省食品药品检验研究院、安徽蓝蓝矿泉水有限公司。本文件主要起草人：XXX、XXX包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法1范围本标准规定了包装饮用水中铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。本标准适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理本方法采用夹心免疫层析原理。样品中的铜绿假单胞菌经滤膜过滤富集，超声处理提取DNAo提取的DNA模板，经过PCR扩增，得到大量的扩增产物。由于上下游引物分别修饰了异硫氟酸荧光素（FITC）和生物素（biotin）,双链的FlTe端可以与胶体金上的FrrC抗体结合，而修饰biotin的一端可以与试纸条检测线（T线）上的链霉亲和素（SAV）结合，在T线形成三明治结构从而导致检测线（T线）颜色深浅的变化，通过检测线（T线）与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中的铜绿假单胞菌进行定性判定。5试剂或材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。5. 1水GB/T6682,二级水。5.2 铜绿假单胞菌标准菌株。5.3 三羟甲基氨基甲烷(Tris)5.4 盐酸(HCI)5.5 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na2H20)5.6 氢氧化钠(NaOH)5.7 TriS-HCl溶液称取TriS(5.3)6.06g,加水(5.1)40mL溶解，滴加HCl(5.4)约2.1mL调PH至8.0,定容至50mL。5.8 EDTA溶液称取EDTA-2Na-2%0(5.5)9.306g,加水(5.1)35mL,剧烈搅拌,用IgNaOH调PH至8.0,定容至50mL。5.9 TE缓冲溶液量取1mLTris-HCl溶液(5.7)于IOomL容量瓶中，再加入0.2mLEDTA(5.8)溶液，定容至100mL。4保存。5.10 铜绿假单胞菌菌悬液用接种环挑取平皿上培养20h24h的铜绿假单胞菌标准菌株(5.2)典型菌落，接种到营养肉汤中，37±1培养1820h,即为铜绿假单胞菌菌悬液，活菌数应达到lxl()8cFUmL5xl8cFUmL05.11 引物上游引物：5,-Biolin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3,下游引物：5'-Fitc-AccgccgtcAgaatcagttt-3,。6仪器和设备6.1 PCR仪。6.2 移液器：0.5L10L,10L-100L,1001000L°6.3 旋涡混合器。6.4 超声波水浴仪。6.5 电子天平：感量分别为0.0Ig和O.Olmg。6.6 胶体金免疫层析检测试纸条。6. 7无菌滤膜：直径47mm,微孔径为0.45m°6.8离心管：200L1.5mL、50mL。7分析步骤7.1水样过滤将250mL水样通过孔径0.45m的滤膜过滤，滤膜备用。7. 2DNA提取将上述步骤的得到的滤膜置于无菌玻璃瓶底部，加入1mL的TE缓冲溶液重悬，再将玻璃瓶置于超声仪中超声8min,尽可能取玻璃瓶中的全部溶液到1.5mL离心管中，500OrPm离心5min,取上清液至新的1.5mL离心管，舍弃沉淀，上清即为含有铜绿假单胞菌的DNA的溶液。7. 3PCR扩增反应PCR扩增体系包括TaqPCRMaSlerMiX25L,上下游引物各0.8L（10molL）,DNA模板2L,ddH2O8.9L°PCR扩增条件为：95预变性501皿；94变性30s,61退火30s,72延伸30s,共35个循环；72再延伸2mino反应结束后取5L扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳中，观察扩增条带。取5L扩增产物琼脂糖电泳,观察扩增条带，产物用于侧向免疫层析检测。剩余PCR产物于4保存备用。7.4测定取2L扩增后产物，滴加在样品垫上，随后滴加48L上样液于样品垫上，通过层析作用，上样液会流向C、T线，静置3min,观察C线及T线的出现情况，观察显色情况，进行结果判定。8质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验。8.1 空白试验取空白试样，按照7的步骤同法操作。8.2 阳性质控试验准确量取空白试样250mL,加入适量铜绿假单胞菌菌悬液（5.10）,使待测液中铜绿假单胞菌的终浓度为IXlO'cFU/mL,按照7的步骤同法操作。9结果分析9.1 通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。判定示意图见图1。9.1.1 无效控制线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示检测结果无效。9.1.2 阴性控制线（C线）显色，检测线（T线）不显色，判定为阴性。9.1.3 阳性控制线（C线）与检测线（T线）均显色，判定为阳性。9.2 质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，阳性质控试验测定结果应为阳性。否则表示不满足质控试验要求，此批样品结果无效。图I目视判定示意图10性能指标10.1 灵敏度灵敏度应295%。10.2 特异性特异性应295%。10.3 假阴性率假阴性率应5%°10.4 假阳性率假阳性率应5%°注：性能指标计算方法见附录A。附录A（资料性）定性方法性能指标计算方法表A.1性能指标计算表样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性NnNi2N=N11+N2阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.=N+Ni2N.2=N21+N22N=NL+Nz或N.i+N.2显著性差异（x2）2=(INi2-N21I-I)2/(N12+N2)，自由度(df)=1灵敏度（p+,%）p+=NN.特异性（p-,%）p-=N22N2.假阴性率（pf-,%）Pf-=Nl2Ni.=100-灵敏度假阳性率（pf+,%）pf+=N2N2=lOO-特异性相对准确度，%C(N11+N22)/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：Nn表示第一行，第一列，NL表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N2表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。
