硫氧还蛋白氧化还原酶thioredoxinreductase,TrxR试剂盒说明书.docx

硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxinreductase,TrxR）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于毗口定核甘酸二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH,是谷胱甘肽氧化还原循环关键函之一。渊定原理：TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrXR活性。自备仪器和用品：低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸储水。试剂组成和配制：试剂一：液体12OmLXl瓶，4*C保存。试剂二：液体2mLxl瓶，4tC避光保存。试剂三：粉剂Xl管，4七保存。临用前加入2mL蒸储水溶解。粗液提取：1 .组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4C离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：试剂一体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）;然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。TrxR漓定操作：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,用蒸储水调零。2 .试剂一在25（一般物种）或者37C（哺乳动物）预热30min03 .空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20L试剂二，20L试剂三，160L试剂一，迅速混匀后于412nm测定IOS和310s吸光度，记为AI和A2。4A空白管=A2-A104 .测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20L试剂二，20L试剂三，140L试剂一，20L上清液,迅速混匀后于412nm测定IOS和310s吸光度，记为A3和A4。A测定管=A4-A30注意I空白管只需测定一次。TrxR活性计算公式：H.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1） .按蛋白浓度计算活性单位定义：在25C或者37中，每亮克蛋白每分钟催化InmolDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/minmgprot）=（ZA测定管AA空白管）+c+dV反总÷（CprxV样）÷T=147×（AA测定管ZA空白管）÷Cpr（2） .按样本质量计算活性单位定义：在25P或者37中，每克样本每分钟催化InmoIDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/g鲜重）=（ZA测定管A空白管）-g÷dV反总÷（WxV样÷V样总）÷T=147×（AA测定管-AA空白管）÷W（3）按细胞数量计算活性单位定义：在25P或者37中，每IO4个细胞每分钟催化InmolDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmolmin104cell）=（AA测定管-ZkA空白管）÷÷dV反总÷（细胞数量XV样÷V样总）÷T=147×（ZA测定管空白管）÷细胞数量（4）按液体体积计算活性单位定义：在25C或者37中，每克升液体每分钟催化InmolDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/minmL）=（AA测定管A空白管）÷c÷dV反总÷V样÷T=147×（ZA测定管空白管）:TNB在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136Imol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积（L）,200L=2×104L;Cpr：上清液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定：W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL）,20L=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间（min）,5min。b.使用96孔板测定的计算公式如下（1） .按蛋白浓度计算活性单位定义：在25X?或者37匕中，每亮克蛋白每分钟催化InmolDTNB还原为1个醉活单位。TrxR（nmol/minmgprot）=（ZA测定管ZA空白管）+c+dV反总÷（CprxV样）÷T=294×（AA测定管ZA空白管）÷Cpr（2） .按样本质量计算活性单位定义：在25X?或者37匕中，每克样本每分钟催化InmolDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/g鲜重）=测定管A空白管）÷c+dV反总÷（WxV样÷V样总）÷T=294×（4A测定管iA空白管）÷W（3）按细胞数量计算活性单位定义：在25X?或者37匕中，每IO4个细胞每分钟催化InmolDTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmolmin104cell）=（AA测定管ZA空白管）+÷dV反总÷（细胞数量XV样÷V样总）÷T=294×（ZXA测定管-AA空白管）÷细胞数量（4）按液体体枳计算活性单位定义：在25X?或者37匕中，每身升液体每分钟催化InmolDTNB还原为1个醉活单位。TrxR（nmol/min/mL）=（ZXA测定管-ZiA空白管）箕÷d'V反总÷V样÷T=294×（ZXA测定管-AA空白管）:TNB在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136Imol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积（L）,200L=2×10-4L;Cpr：上清液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定；W：样品质量；V样:加入反应体系中上清液体积（mL）,20L=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间（min）,5mi11o注意事项：1 .测定前须先取12个样做预实验，哺乳动物组织及血液制品TrXR活力测定时，一般须用蒸储水稀释5倍左右；测定过程操作须迅速。2 .试剂二和试剂三配制好后3天内使用完。