三种腐败菌是阴沟肠杆菌蜡样芽孢杆菌费格森埃希菌3实验方法.docx

三种腐败菌是阴沟肠杆菌蜡样芽胞杆菌费格森埃希菌3.3实验方法第一部分实验单因素部分数量30指标33.3.1 两种腐败菌菌悬液的配置将通过高通量测序分析确定的三种优势腐败菌(阴沟肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、费格森埃希菌)，从冻藏管中取出在30C下培养24h,并将活化过的菌液分别经过3次传代恢复活性，制备菌液浓度为l()8cFUmL的菌悬液备用。3.3.2 抑菌剂溶液的配置根据GB2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准中，规定的使用最大限量，设置选择等梯度浓度对两种优势腐败菌进行抑菌实验。抑菌剂种类最大限量/(gkg)乳酸链球菌素0.5百里醍，百里香酚食品香料以聚赖氨酸0.25肉桂醛食品香料，按生产需要适量使用二氢棚皮素新食品原料，摄入量VIOorng/天茶多酚03表3-16种抑菌剂使用限量抑菌剂种类抑菌剂浓度/(gkg)123456乳酸链球菌素00.10.20.30.40.5百里香酚00.10.20.30.40.5£-聚赖氨酸00.050.100.150.200.25肉桂醛00.20.40.60.81.0二氢棚皮素00.150.30.450.60.75茶多酚00.060.120.180.240.3表3-26种抑菌剂浓度梯度表阴沟肠杆菌使用的6种抑菌剂抑菌浓度按照上表6种抑菌剂*5个浓度蜡样芽抱杆菌使用的6种抑菌剂抑菌浓度按照上表6种抑菌剂*5个浓度费格森埃希菌使用的6种抑菌剂抑菌浓度按照上表6种抑菌剂*5个浓度3.3.3 抑菌剂抑菌活性测定3.3.3.1 菌悬液的制备将3株优势腐败菌(阴沟肠杆菌、蜡样芽胞杆菌以及费格森埃希菌)从冻藏管中吸取200PL溶于100mI的液体营养培养基中，在37下培养18h进行活化，活化的菌液经过3次划线传代后恢复其活性。挑取传代后的菌株到100ml液体营养培养基中，在37下培养18h后得到菌悬液以备后续使用。3.3.3.2 “打孔法”抑菌圈选择合适抑菌浓度分别将三种优势腐败菌菌悬液吸取IOml加入到冷却至50C的500ml固体营养培养基中，混合均匀后倾注于培养皿中，待培养基凝固后，用打孔器在培养基上打直径为6mm的孔,在小孔中注满相应的抑菌剂。加完抑菌剂的平板放到4的冰箱内使其充分扩散后再37下培养24h70,用游标卡尺测其抑菌圈大小。预期实验结果：得到每种抑菌剂的抑菌效果，并绘制类似下图的柱状图注:av、A-C»X-Z字母不同表示差异显著(p<0.05)图4乳酸链球菌素对3种腐败菌的抑菌效果第二部分实验3.3.4.1抑菌剂最低抑菌浓度(MinimuminhibitorycoiiceiitratioibMIC)的测定将第一部分实验选出的效果最好的三种抑菌剂(A、B、C)依次稀释2倍，利用打孔法观察其是否出现抑菌圈，进而选择合适的最低抑菌浓度。预期实验结果例子：.M竦MNS收他的舱帆梅，甩MCIIoMc44.MInImMmmhbioryc4mcCTr¾to<MCIMnring>nlthreePUlrCIchehacCT¾.ft川家发320.1.02S0。125.0M2S(N)I2S0401S625""*5mH""""-".龟的比ft>Itaitirv从找J中叩以SHL我坊*HGHl磬*克修改S帐“纨浓度分明XaoSB，“.(MK>U5rig.0.002Sg.NrtiMVtfXff飨2。的*F，望ItVU*Uie试3中第MffFRi为Q05,¾f.334.2三种天然抑菌剂对三种腐败菌最低抑菌浓度表3-1试剂A的最低抑菌浓度Tab.3-6MinimuminhibitoryconcentrationofA腐败菌A的浓度(gkg)0.10.050.0250.01250.006250.003725阴沟肠杆菌蜡样芽胞杆菌费格森埃希菌+-+-表上数据要等第一部分实验结果，有抑菌圈为+,无标-表3-2试剂B的最低抑菌浓度Tab.3-6MinimuminhibitoryconcentrationofA腐败菌B的浓度(gkg)0.10.050.0250.01250.006250.003725阴沟肠杆菌蜡样芽胞杆菌费格森埃希菌+-+-表上数据要等第一部分实验结果，有抑菌圈为+,无标-表3-3试剂C的最低抑菌浓度Tab.3-6MinimuminhibitoryconcentrationofA腐败菌C的浓度(gkg)0.10.050.0250.01250.006250.003725阴沟肠杆菌蜡样芽胞杆菌费格森埃希菌+-+-表上数据要等第一部分实验结果，有抑菌圈为+,无标-第三部分实验3.3.5.1复合天然抑菌剂响应面设计在抑菌圈实验基础上，根据Box-Behnken实验设计原则，并结合单因素抑菌实验结果，设计3因素3水平共17个响应点的响应面实验，将第一步筛选出的三个具有最大抑菌圈直径试剂的浓度作为实验因素，以三种腐败菌的抑菌圈直径作为响应面值进行实验。进而得到最优复配抑菌剂配方。响应面实验因素设计如下表。并进行验证实验，最终得出对腐败菌抑制作用最佳的复配天然抑菌剂组合。表3-3响应面实验设计表Tab.3-5Responsesurfaceexperimentaldesigntable田方水平因nX-101/(gkg)/(gkg)/(gkg)33.5.2响应面实验结果及模型建立与分析多因素部分数量17指标3表3-4响应曲面实验结果Tab.3-9Responsesurfaceexperimentalresults阴沟肠杆菌蜡样芽胞杆费格森埃希试验号/(gkg)/(gkg)/(gkg)抑菌圈宜径菌抑菌圈直菌抑菌圈宜mm径mm径mm1234567891011121314151617