大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化.docx

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化开展进程中的重要工具。因此热练掌握并运用大肠杆菌表达系统的根本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的根本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1 大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如入PL,cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如Iac,trc,tac,T5lacoperator,T5lacoperator等.根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达教体和融合表达载体“融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折，催，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位.常用的用丁亲和纯化眼合标签包括Poly-Arg.Poly-His,Strep-Tag,S-tag.MBP等。其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的.HisTag大多数是连续的六个HiS融合r目标蛋白的N端或C端，通过HiS与金属离子：Cu2+>Fe2*>Z112+>Ni2的按合作用而实现亲和纯化，其中Ni”是目前使用最广泛的,His标签具有较小的分子量，融合r目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除.目前常使用的表达载体主要是由NOVagen提供的PET系列和Qiagen公司提供的PQE系列。除了HiS标签外，复原性谷胱甘肽S-转移施是另一种实验室常用的融合标签,它可以通过复原性谷胱甘肽琼脂精亲和层析而快速纯化。此外，与HiS相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST具有较大的分子量（26kDa）,可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST取合表达系统主要是由GEHealthcare（原AmerSha提供。宿主菌的选择重组财粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，脑粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coliDH5,E.coliJM109.E.coliDHIOB,E.coliNOVaBIe等recA一和。流一型细胞.作为表达宿主菌必须具备几个根本特点：遗传稔定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验宽常用的几种表达宿主：BL2：Ion和OmPT蛋臼酸缺陷型，防止了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体.适用于Tac,Trc,Lac,PL,cspA等作为启动子的载体。BL21（DE3）：DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌JPTG诱导的IaCMV5启动子控制T7RNA聚介酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的根底上，Novagen公司开发r一些特殊的表达宿主细胞.比方：Origami（DE3）,OrigamiB（DE3）和ROSetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变“拥有trxB和gor突变的曲株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二疏键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。RoSettaIM系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核Ig白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-CodonPlus系列：包括BL21-COdonPIUS"DE3）-RIPL,BL21-CodonPluS®-RIL.BL21-CodonPlus®（DE3）-RIL,BL21-CodonPlus®-RP.BL21-CodonPlusr（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆喇魂码精氨酸（R）,亮氨酸（L）,异亮/酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含应高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。M15/SG13009：自身表达T5RNApolymerase,主要用于PQE系列载体的表达。另个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表1大肠杆菌密码了使用频率统计TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFRQTTTF19.7TCTIS5.7TATY16.8TGTC5.9TTTCF15TCCS5.5TACY14.6TGCC81TTAL15.2TCAS7.8TAAstop1.8TGstop1TTGL11.9TCGIS8TAGstop0TGGW10.7CTTL12CCTP8.4CATH15.8CGTR21.1CTCL11CCCP6.4CACH13.1CGCR26CCTAL5.3CCAP6.6CAAQ12.1CGAR4.3CTGL46.9CCGP26.7CAGQ27.7CGGR4.1ATTI30.5ACTT8AATN21.9AGTS7.2AATC130.6ACCT22.8AACN24.4AGCS16.6AATAI30.7ACAT6.4AAAK33.2AGAR1.4ATGM30.8ACGT11.5AAGK12.1AGGR1.6GTTV16.8GCTA10.7GATD37.9GGTG21.3GTCV16.9GCCA31.6GACD20.5GGCG33.4UGTAV16.1GCAA21.1GAAE43.7GGAG9.2GTGV16.11GCGA38.5GAGE18.4GGGG8.68. 2表达条件的建立为了方便后续的纯化操作，保持目标蛋白的活性，提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大限制齐之前应该首先确定目标蛋白的最正确表达条件.首先，保证表达蛋白稳定，尽量防止蛋白醛的降解，我们可以通过使用一些蛋白的缺陷性的友达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加些蛋白的抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时帔保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因住大肠杆菌表达时很容易收或不可容的包涵体，其原因可能有：表达金过高，*缶”二曲体，表达量越高越春切匕成包涵体:蛋门合成速度太快，以至没有足够的时间进行折叠，藐键不能正确配对:过多蛋白间的非特异性蛋白质无法到达足够的溶睇度等。目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。确定表达状况转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37,c.200rpm,培养至ODbW=0.5左右，参加IPTG至终浓度0.2mM,转移至28tc,200rpm继续诱导培养，可以在2h,4h,6h分别取样以分析表达状况。将取出的IInI菌液1200OrPnl离心InIin,收集菌体，参加ImlPBS缓冲液重悬沉淀，同样离心Imin。再参加300500mlPBS重悬细胞。超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）将破碎液体4。12000rpm离心IOmin,别离上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。假设在上消中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化日标蛋白。假设Fl标蛋白的表达主要分布于沉淀，那么可以尝试一下几种方法来改善表达。改变表达载体下手，像GST,NMS,MBP,TrXA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆曲中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的PeIB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。降低表达速度,可采取低温诱导,如15c诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxinredctase/gltathioneredctase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体，帮助形成更多的:硫键。对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯的解决方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作.可以用来检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布等），用来分析纯化的目的蛋白的纯度。本小节列出SDS-PAGE操作中一些试剂的配置及其根本的操作过程。.1主要试剂的配置1 1）30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和IgN,N,一亚甲双丙烯酰胺溶于IoomI热水中，验证其PH值不大于7.0.置棕色瓶中，4c保存。丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。建议实验室划出专门的台面,设置单独的配置器皿进行Sds-PAGE的相关实验。1.5molLTris（pH8.8）溶液。（3）10%SDS溶液：SDS10.OgddH20ToTolOO：（4）10%过硫酸筱：新鲜配制。（5）TEMED溶液：4?保存。（6）1.0mol/LTris（pH6.8）溶液。（7）2X样品溶解液：2%SDS,5%筑基乙醉，10%甘油，0.02%漠酚蓝，0.01molLTris-HCl（pH8.0）缓冲液。（8）5XTris一甘氨酸电极绫冲液：15.IgTris,94g廿氨酸和5gSDS定容到IooomI（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。（9）考马斯亮蓝R染色液：每100InI甲醉、水、冰乙酸混合物（9:9:2）,溶解0.25g考马斯亮蓝R,搅拌溶解.（10）脱色液：10%冰船酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醉）。.2主要操作步骤1、凝胶制备（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。（2）配制10%的别离胶（具体参考表2）：迅速在两玻璃板间隙中港注别离胶，直至剜余的板宽比梳子长度多ICnL小心在胶上覆盖薄层异丙醇或水.（3）在别离胶聚合的过程（可置于37c,约Iomir中，出制5%的积层胶（参考表格3）。（4）别离股聚合完全后，倒去异西醉或水，用滤纸吸干胶面上的剩余。（5）濯注积层胶，立即插入干净的梳子，防止产生气泡。（6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，拨去封胶用的塑料条，固定于电泳槽。（7）在上下电泳槽中参加足够的电泳缓冲液。2、样品的制备在蛋白溶液中参加等体积的2X样品溶解液，混合液在沸水浴中加热5min,冷却后即可上样。3、上样用微量移液器上样,每参加种样品,上样量根据根据具体的样品浓度确定，未知浓度般用10微升。4、电泳对于一块胶，在浓缩胶中电流设置在1520mA,当染料进入别离胶后可设置电压至电流约为2530mA,维续电泳直至染料到达离凝胶底部ICm处。5、后处理（1）染色：参加染色液（用量同上），室温染色30minlh.Tip：染色前可将染色液在微波炉里加热至沸，然后摇床震荡染色约IoInin即可。（2）脱色：将染色后的胶块用水洗涤三次去除外表染料,然后参加脱色液脱色,其间更换脱色液34次至条带清晰。Tip：IOmin快速脱色：将脱色液置于微波炉煮沸，更换三次脱色液。不同体积(ml)凝胶液中各成分所需体积(ml)Gel%组成所需要各成份体积(ml)51015202530水2.65.37.910.613.215.930%丙烯酰胺溶液1234566%1.5molLTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.024水2.34.66.99.311.513.930%丙烯酰胺溶液1.32.745.36.788%1.5molLTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.018水1.945.97.99.911.930%丙烯酰胺溶液1.73.356.78.31010%1.5molLTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012水1.63.34.96.68.29.930%丙烯酰胺溶液2468101212%1.5molLTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012水1.12.33.44.65.76.930%丙烯酰胺溶液2.557.51012.51515%1.5molLTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012表3.SDS-PAGE5%浓缩胶的配置Gel%组成所需要各成份体积(ml)123456水5%30%丙烯酰胺溶液0.681.42.12.73.44.10.170.330.50.670.831.01.Omol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.7510%SDS0.010.020.030.040.050.0610%过硫酸氨0.010.020.030.040.050.06TEMED0.010.020.030.040.050.068 .3细胞破碎获取蛋白质大肠杆菌细胞破碎有很多方法，譬如反曳冻融法，渗透冲击，超声破碎，压力破碎等.其中超声破碎和压力破碎破碎是我室常用方法。超声破碎在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心L0-1.5ml诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量参加300-5001的缓冲液盎悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器，各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下（以Iooml培养液为例）：（1）100ml诱导后的菌液（ODwx）=1.2左右），12000rpm,4c离心2min,收集菌体。（2）参加预冷的缓冲液50mL重悬细胞洗涤菌体一次，12000rpm.4c离心2min收集菌体：常规的操作所使用的缓冲液多为PBS或者Tris-NaCl,针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。对于一些蛋白的敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中参加一些蛋白酹抑制剂。（3）向沉淀中参加15Inl的缓冲液同上（假设菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30SeC间隔Inlin使菌液冷却，输出强度为56,频率为6070%。（5）别离上消和沉淀：12000rpm,4c离心20min,别离上消和沉淀。（6）SDS-PAGE分析蛋白表达情况。（7）准备纯化蛋白。超声破碎考前须知与一些小的改进：（1）破碎完全的判断：超声前阑悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。（4）尽量防止泡沫的产生。（5）大量破碎时将菌液置于玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热,减小对蛋白的破坏作用。（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100g/ml）处理破环细胞壁（10min,30c）,增加细胞的通透性。压力破碎高压破碎是大量的破碎提取细胞内成份的首先方法，相对于超声破碎，它具有过程汉和，操作迅速等优点，具体使用需要根据具体的仪器使用说明.FRENCHePRESS细胞破碎仪标准操作例（1）使用前将高压腔、底座、活塞杆在4c冰箱中预冷30min。（2）将三脚固定罂置于水平桌面上，将高压腔正放在固定器器上；在活塞杆的0型环、底座的0型环和针形阀的0型环上均匀涂上少任凡土林.（3）把活塞杆正向插入高压腔至鼠大加样线，将整个腔体连同活塞杆一起倒转固定在固定器上。（4）将菌液倒入腔体，最大处理量为35InL最小为5mL视样品体积，大致估计并调整活塞杆的位置。（5）将针形阀和样品喷射管装配于底座上，针形阀拧到轻轻不能拧动为止，并向反方向稍微松动，保证脚门处于开启状态（注意：务必不能用力拧紧，否那么会降低其密封性）.把底座倒扣腔体上，向上调整活塞杆的位置，直至腔内空气完全排出，流出一滴样品为止，轻轻旋紧针形阀（6）双手托起整个高压腔组件,翎转至正向位置，将其置于升降台上（事先要确保操作台足够的低，以容的下整个组件），向后推动底座，使底座固定于三个位置校准针之间，并调整腔体使针形阀朝向正面。将固定夹固定于支持杆上，拧紧固定夹上的两个螺丝以固定腔体。符活寒杆上的手柄转至与固定夹垂直的方向。（7）翻开电源，将档位手柄转至HlGH档，顺时针旋转压力控制阀至50psi,升降台开始上升，当活塞杆接触上顶台后，维续顺时针旋转压力控制阀，直至压力到达需要的压力（大肠杆菌的破碎压力一半设定为12000psi,芽胞杆菌设定为2000psi）。（7）取冰预冷的离心管（或者将离心管至于冰中）宜于样品喷射管出口处，轻轻逆时针转动针形阀，小心控制样品的流出速度，根据破碎程度决定流速（建议在喷射管出口处接一个ICm长的透明的塑料管如输液管，通过观察塑料管流出样品的透明度来判断破碎是否完全）。当活塞杆上的平安指示线（StopLine）降至腔体上外表时，迅速关紧针形阀（不要过禁）.旋转档位手柄至DoWN位置。待升降台完全下降后，继续降低压力至零，关闭电源.（8）松开固定夹，取出高压腔，重新倒置于三脚固定器上，取出底座.将各局部拆开，彻底清洗。底座及喷射管的内壁耍重点冲洗，涂有凡土林处要用洗洁精彻底洗净。【考前须知】（1）仪器最大承受大力为400OPSi（指示针2500）。（2）各0形环处（包括样高压腔，底座，活塞杆和针形阀）一定要涂凡士林润滑，以降低磨损，防止损伤。（3）压力的升高或降低速度要控制在一定范围内。升高压力前务必保证整个组件固定于升降台上,任何的松动可能导致事故。（4）活塞杆的手柄要与固定夹垂直，否那么会发生危险。（5）严禁将出样阀过分拧紧，否那么会损坏内部撞针，以不流出液体为准。（6）严禁使活塞杆卜至平安线以F,否那么会导致活塞杆与底座根坏。（7）使用完毕要将压力控制阀转至压力为零。（8）各部件清洗要彻底，否那么底座小孔容易堵死，活塞杆上残留的菌体会在未洗净的凡士林上滋生。（9）长期不用应保存在枯燥的环境中，必要时可涂凡士林防止生锈。（10）压力腔的空气一定要完全推出，否那么当样品完全排出时，造成活塞与压力池底座直接接触，造成损伤，由于压力非常大，有可能导致活塞或压力池底座变形，造成永久性损伤！（11）在搬动装好的样品池时，定要双手，手扶住住高乐腔，手托住底座,防止底座脱落而造成事故。（12）0型环假设老化那么及时更换。（13）操作过程中禁止将液体溅入机箱内部。（14）仪器使用过程中出现故障庖及时与负责人联系。9 .4目的蛋白的纯化HisTag纯化操作实例本实验室中所用的表达载体pET28a（+）中含有一个编码多聚组纵酸的序列，即His-Tag,因此会获得带有HiS-Tag的重组目标蛋白，HiS-Tag可与金城Ni?离子结合，从而有利于目标蛋白的纯化。加上了HiS-Tag的蛋白在非变性的条件下可用Ni?,亲和层析柱纯化。纯化蛋白的原理是：当亲和层析柱负载了Ni?后，可以选择性吸附暴露在蛋白外表具有夏杂结构的第基酸残基（特别是组氨酸残基）,蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni?结合的特异性就越高，那么将其洗脱下来会需要更高的咪嚏浓度。含有组包酸标签的目标蛋白与细胞中的总蛋白相比，具有更高的Ni"结合特异性。为了得到具有较高纯度的目标蛋白，必须找到一个适宜味陛浓度的洗脱液（结合缓冲液），在此浓度卜.非特异性的杂蛋白能从柱上洗脱卜来，而与Ni4特异性结合的FI标蛋白不会被洗脱。最后用更高咪嚏浓度的缓冲液（洗脱缓冲液）将目标蛋白洗脱下来，此时目标蛋白特异性的存在于该咪喋浓度的洗脱液中，从而得到纯化了的目标蛋白质。.1重组蛋白的诱导（1）载体构建：本实验采用pET-28a（+）表达我体，克隆受体菌为E.coliDH5,表达宿主为E.coliBL21（DE3）.具体操作参考基因克隆与转化局部。（2）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含100g/m卡那霉素和），于37c过夜培养。（3）取Iml过夜培养物，转接于100mI含IoOg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37c培养L52小时至对数生长期，（4）在培养物中参加异丙基硫代半乳糖甘（IPTG）至终浓度为0.2mM,按照预先建立的最正确表达条件进行诱导表达。（5）1200rpm,离心2min,收集菌体。（6）弃上清，向沉淀中参力口50OmlStartingbuffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaftPO,200mMNaCL10%此油.PH7.0）,充分悬浮洗涤菌体。（7）12000rpm,离心2min,收集地体。（8）向沉淀中参加15ml的Startingbuffer,重悬菌体。（9）冰浴条件超声波处理3min,每处理30SeC间隔Imin使菌液冷却，输出强度为56,频率为6070%,处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准.（10）12000rpm,4匕离心20min,将上清移到干净灭过菌的50ml离心管。SDS-PAGE分析Ig白的表达情况。假设目的蛋白分布在上清中，继续进行卜面的纯化操作。.2目标蛋白的体外纯化（1）灌制好Nl=NTA亲和整析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，防止在柱床中引入气泡.（2）用10倍柱床体枳的Startingbuffer进行预平衡，上样，将细胞破碎后的上清液注入Ni”NTA亲和层析柱中。（3）用10倍InI的Startingbuffer进行漂洗，收集浊过液。（4）开始用5倍柱床体枳的含20mM咪哩的Startingbuffer进行洗脱，并对洗脱液进行收集。（5）依次用5倍柱床体积的含40mM,60mM,80mM,100mM,200mM,300mM和500InM味哩的startingbuffer进行洗脱,分别对洗脱液进行收集。（6）通过SDS-PAGE检测回收的效果，确定咪哇最适宜洗脱浓度。（7）从每管收集的滤出液取出IoIII的样品，参加101的2XSDS凝胶加样缓冲液，摇匀。（8）沸水浴处理3min,（9）取出样品,将IoUl样品全部上样于适当浓度的SDS聚丙烯院胺凝胶上电泳。【考前须知】（1）样品可贮存于4c,以备在聚丙烯酰胺凝胶上加样。（2）用考马斯亮蓝或根染液进行染色，检测重组蛋白的纯化程度，并找到咪哇最适宜洗脱浓度，也就是纯化蛋白含量最多的管洗脱液所对应的浓度：并将该纯化出来的蛋白质经过PD-IO柱子以去掉溶液中的味哇。（3）蛋白质被洗脱完成之后，要及时地清洗柱子，使柱子能垂且使用。（4）在下次对同一蛋白的纯化过程中，即可根据胶图所显示的个洗脱液中蛋白浓度的情况来优化整个洗脱过程。蛋白质溶液的去盐处理（使用Pi）-IO去盐柱）（1）用Ioml的startingbuffer平衡PDTO去盐柱。（2）上样：往PD-Io去盐柱中参加2.5ml的蛋白质溶液。（3）用IOmI的Startingbuffer去洗PD-Io去盐柱，开始收集浊出液，每ImI收集管。离心管应该先在冰上预冷。（4）电冰检测亚组蛋白质的纯化程度。（5）具体方法和过程与上面步骤致。（6）选择适宜的纯化蛋白样品，参加1倍体积的货冷甘油。接着将蛋白质样品置r-80c保存，以备使用。【注意】PD-Io去盐柱可以屡次反复使用，但是不能使柱子变干，保存时应该用相应的暖冲液浸泡，并且置于4c。图1：PD-Io去盐柱除去盐离子示意图（载自AmerShamBiOSCienCeS产品说明）.3His-tagNOTE（1）假设HiS标签蛋白没有结合，请依次检查：可能原因1：样品或者是结合镀冲液不正确。策略：检测PH及样品和结合绫冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强复原剂的浓度及咪嚏的浓度不是太高.可能原因2：组氨酸的标签没有完全的暴露。策略：在变性条件下（用48M眼，或4-6M耗酸脏）进行纯化。可能原因3：HlS标签丧失。策略1：WB或者anti-his的抗体检杳HiS是否表达，上游构建，改变his-tag的位置（C-terminalorN-terminal）,必要时增加his个数（常用610个）：策略2：孵自的时间不够，降低潦速和增加孵育的时间；策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最正确的结合金属离子。（2）假设没仃洗脱下来，请依次检查：可能原因1：洗脱条件太湿和（组窈酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）“策略：用增加咪睡的梯度洗脱或降低PH来找出最正确的洗脱条件。可能原因2：降低PH的方法洗脱的，因为假设PH低于3.5,会导致镣离子脱落。策略：改变洗脱方法，味晚竞争性洗脱。可能原因3：蛋白已沉淀在柱上。策略：减少上样量，或使用味哇的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaeI的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用48Mjk,或46M盐酸胭）。可能原因4：非特异性疏水或其他相互反响“策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%TritonX-100）或增加NaCI的浓度。（3）HIS标签蛋白洗脱后杂带较多，什么原因？如何优化？高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS,所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有些杂带，可能的原因和优化的方法如下：可能原因1：蛋白的局部降解了标签蛋白。策略：请添加蛋白的抑制剂，（慎用EDTA）。可能原因2：杂质对银离子有更高的亲和性。策略1：咪畦浓度必须优化，以确保裔纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组犯酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最正确平衡，分步或者线性洗脱摸索出最优的咪喋结合和清洗浓度：在样品中参加与结合级冲液同样浓度的咪唯：味畔的梯度不大（20个或更多的柱床体枳），可能别离出有相似结合强度的蛋白。策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，PH的他围都需要进行筛选，以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和更原剂设计成几个不同的混合配方。可能原因3：杂质和标签蛋白结合在一起。策略：在超声破碎细胞之前参加去垢剂或者复原剂：增加去垢剂的浓度，（2%TritonX-100or2%Tween20）；或者在WaShbuffer中增加甘油的浓度（50%）减少非特异性的相互反响：考虑增加咪陛的浓度或者改变金属离子可能原因4：洗涤不充分.策略：增加洗涤的次数，使洗涤充分。.4NTA树脂的再生NTA树脂在使用假设干次数（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白脑的结合效率。注意：NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按以下次序将再生试剂加到层析柱里，在等上再生溶液流干后，再加下再生溶解。用户需要自行准齐25%,50%.75%,100%（v/v）乙醇和去离子水。NTA再生步骤：（1）从层析柱卜.端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的0.2MAceticAcid6MganidineHCl洗。（2）用2倍体积的去离子水洗。（3）用3倍体枳的2%SDS洗。（4）用1倍体积的25%乙醇洗。（5）用1倍体积的50%乙醇洗。（6）用1倍体枳的75%乙醇洗.（7）用5倍体枳的100%乙醇洗。（8）用1倍体积的75%乙醇洗。（9）用1倍体积的50%乙砰洗。（10）用1倍体积的25%乙醇洗。（11）用1倍体积的去离子水洗。（12）用5倍体枳的0.IMEDTApH8.0洗。（13）用3倍体枳的去离子水洗。（14）如果立即使用，用5倍体积的IoOmMNiS04.6H20洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-Obuffer或GNTA-Obuffer）洗。（15）如果想长期储存，参加1倍体积的20%乙醉，4度保存，使用前需要执行步骤14。GST亲和标签的纯化谷胱田肽S一转移酹（GST）是维组氨酸之后的第二个应用最多的重组蛋白标记。GST融合于目标蛋白的N端，可以通过谷胱廿肽一琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对底物复原性谷胱甘肽的亲和力是亚摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂就形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。用ImI的树脂纯化IL的大肠杆菌培养物可得到的目的蛋白产率为0.16.Omg.GST亲和纯化融合蛋白主要包括结合，洗涤，洗脱三个步骤，全过程只需要一到两种缓冲液，可以大量纯化，也可以小量的实现快速纯化。非常适合实验室小量制备大肠杆菌重组蛋白。下面以克隆到表达载体pGEX-6p-l上的GFP表达纯化为例，介绍一种小量快速的纯化方法，供大家参考。蛋白的诱导与样品的制备方法根本同上。.1GST亲和标签纯化的使用（1）从4c冷柜中取出GItathioneSepharose4B（本产品购置GE公司，储存于20%乙醇,树腑的员和20%乙醇1：1）.轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。（2）用宽嘴吸头吸取ImI的脂浆，参加到装有40InI的PBS（整个操作过程所有的PB均需预冷）V型离心管中，轻柔颠倒数次，洗深除去残留的20%乙醉，2000rpm,离心5min,小心倾倒出PBS。（3）将破碎后的上清参加平衡上一步骤中的树脂中，轻轻混匀，4c振荡温白，500rpm,Ih,期间不断混匀，防止树脂沉淀，保GST-GFP充分结合于树丽上。（4）2000rpm,离心5min,小心倾倒出上清。（5）向沉淀中参加约40ml的PBS,轻柔混匀，振荡温白IOmin,2000rpm,离心5min,小心倾倒出上消。（6）重夏步骤（5）一次，然后向沉淀中参加5ml的PBS悬浮树脂，并将悬浮液转移到一个Ioml的塑料层析柱，并翻开阀门放掉PBS。（7）洗脱收集目的蛋白。根据实验需要不同为两种方法来收集目的蛋白。方法一：是不切除GST-tag,可以向（6）中的树脂中参加l-2ml的洗脱缓冲液（50mMTris-HCl.10mM复原性谷胱甘肽（GSH）,PH8.0）,轻轻混匀然后4c温穹IOmin,收集潦出液，即为GST-GFP的纯化产物。方法二：是纯化不含GST-tag的蛋白，按照说明书将蛋白酣PreSCiSSiOnProtease（GE公司）用PBS稀释到到ImL参加到（6）中的树脂中，轻轻混匀然后4*c温百12h,收集流出液，即为GFP的纯化产物。（8）SDS-PAGE分析纯化的蛋白。可以对操作过程中的每步取样进行SDS-PAGE分析。.2GllitathioneSepharose4B再生GSTBind树脂可以重复使用数次而无需再生,但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载量都卜.降。为了去除结合在树脂上的蛋白，可以用10倍体枳的50mMTris-HCl,0.5MNaCl,pH8.0洗树脂，接着用10倍体积的IoomM醋酸钠pH4.5,0.5MNaCl再洗一次。其它可以选用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：6M尿素，6M盐酸脏或低极性溶剂，如5070%乙醇或50%乙：醉。任何上述处理后应该立即用10倍柱体积IXGSTBind/Washbuffer平衡，树脂可以在4*c下，20%乙静/80用水中长时间存放。.3GST使用过程中可能的问题与对策（1）目标蛋白结合效率低结合条件不对：仔细核对各种溶液、线冲液的成分和pH：低于pH6.5或高于pH8时，融合蛋白与GSTBind树脂会结合不充分。确保树脂在与细胞裂解液结合前经过pH6.5-8.O缓冲液（如IXGSTBind/Washbuffer,PBS）的平衡细胞裂解前参加DTT会显著改善某些GST融合蛋白与GSTBind树脂的结合GST融合蛋白被超声打断降解：过度超声会破坏带标签的蛋白而减