基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证.docx

基于网络药理学探究黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证马旭东'2杨进2陈林"A吴波3李嘉"2王威威梁国标'(L遵义医科大学贵州遵义563000；2.成都大学附属医院；3.郭都区人民医院)摘要：目的：利用网络药理学、生物信息学，研究黄杨碱抑制肾癌的作用机制，并通过人肾癌细胞系786-o,CakiT进行体外实验验证相关预测结果。方法：首先从PharmMaPPer数据库检索黄杨碱(CVB-D)的作用靶点，DiSGeNET数据库获得肾癌疾病靶点，随后通过venny平台整合CVB-D治疗肾癌的潜在靶点，把潜在靶点导入String数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)»然后将String数据导入CytOSCaPC中修饰，并用CytOHUbba插件进一步分析网络中的HUb基因，得到的HUb基因用TCGA数据库作表达差异及生存分析。此外再用CVB-D与肾癌的交叉靶点数据进行GO和KEGG富集分析，得到黄杨碱治疗肾癌的潜在靶点中的分子功能及相关作用信号通路等分析结果。最后采用CCK-8、克隆形成、观察细胞形态实验、WeSternblOt实验验证CVB-D对肾癌的作用结果。结果：分析得到CVB-D潜在作用靶点136个，疾病作用靶点2085个，CVB-D治疗肾癌的预测作用靶点68个，核心靶点5个。靶点共涉及生物过程238种，细胞组成30种，分子功能59种，参与肿瘤、PI3K-AKT.前列腺癌等细胞信号通路222条；CCK-8、克隆形成、细胞形态实验结果表明，与对照组相比，CVB-D能显著抑制肾癌细胞的活力与增殖能力，呈浓度依赖性；流式细胞凋亡分析表明CVB-D能促进肾癌细胞凋亡，从而抑制肾癌细胞；Westernblot实验表明CVB-D作用后细胞中EGFR、p-PI3K.P-AKT相对表达水平降低，呈浓度依赖性，与空白组相比存在统计学差异(P<0.05)结论：黄杨碱可能通过EGFR靶点和PI3K-AKT信号通路诱导人肾癌细胞凋亡，从而在肾细胞癌的治疗中发挥重要作用。关健词：网络药理学；生物信息学；黄杨碱；肾细胞癌；表皮生长因子受体；PI3K-AKT通路ExplorationofthemechanismandexperimentalverificationoftheinhibitoryeffectofCyclovirobuxineDonrenalcellcarcinomacellsbasedonnetworkpharmacologyMaXudong12,YangJin2,ChenLin2iWuBo3iLiJia12tWangWeiwei,2,LiangGuobiao1l(1.ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563(X)6,China;2.AffiliatedHospitalofChengduUniversity;3.PiduDistrictPeople'sHospital,Chengdu)ABSTRACTObjective:TostudythemechanismofCyclovirobuxineDinhibitingrenalcarcinomawithnetworkpharmacologyandbioinformatics,andverifyingthepredictedresultsthroughhumanrenalcarcinomacelllines786-0,Caki-Iinvitro.Methods:Firstly,retrievingthetherapeutictargetsofCVB-DfromPharmMapperdatabase,andtherenalcancertargetsfromDisGeNETdatabase.ThenintegratingthepotentialtargetsofCVB-DforthetreatmentofrenalcancerthroughVennyplatform,andconstructingtheprotein-proteininteractionnetwork(PPI)throughStringCytoHubbaplug-ininCytoScapewasusedtofurtheranalyzeHubgenesinthenetwork.Afterwards,analyzingtheexpressiondifferencesandsurvivalof*成都大学附属医院攀登人才计划(编号：RCJH-01-04)；成都优秀卫技人才发展专项资金；成都市医学科研课题()；成都大学临床医学院附属医院创新团队项目(CDFYCX202207)通信作者Tel：E-mail：HubgenesbyTCGAdatabase.Furthermore,thedataofthepotentialtargetsofCVB-DforthetreatmentofrenalcancerwereanalyzedbyGOandKEGGenrichmentanalysis,andthemolecularfunctionsandrelatedsignalingpathwaysofpotentialtargetsforthetreatmentofrenalcancerbyCVB-Dwereobtained.Finally,cck-8,Clonogenesis,cellmorphologyandwesternblotwereusedtoverifytheeffectofCVB-Donrenalcarcinoma.Results:136potentialtargetsofCVB-D,2085diseasetargets,68predictivetargetsofCVB-Dinthetreatmentofrenalcancer,and5coretargetswererecognizedafteranalysis.Targetsarerelatedto238kindsofbiologicalprocesses,30kindsofcellcompositions,59kindsofmolecularfunctions,andparticipatedin222cellsignalingpathwayssuchastumor,PI3K-Akt,prostatecancerandsoon.Comparedwiththecontrolgroup,CVB-Dcansignificantlyinhibittheviabilityandproliferationofrenalcarcinomacellsinaconcentration-dependentmanner.FlowcytometryanalysisshowedthatCVB-DcouldpromotetheapoptosisofrenalcarcinomacellsandinhibittherenalcarcinomarnblotexperimentshowedthattherelativeexpressionlevelofEGFR、p-PI3K、p-AKTincellstreatedwithCVB-Ddecreasedinaconcentrationdependentmanner,whichwasstatisticallydifferentfromthatintheblankgroup(P<0.05).Conclusion:CVB-DmayplayanimportantroleinrenalcellcarcinomabyregulatingcellproliferationandapoptosisthroughPBK-AktsignalingpathwayandEGFR.Keywords:Networkpharmacology;Bioinfbrmatics;CyclovirobuxineD;Renalcellcarcinoma;Epidermalgrowthfactorreceptor;P13K-AKTpathway肾细胞癌是泌尿系统最常见和最具风险的肿瘤之一，约占全世界所有确诊癌症数的5%IJ,主要发生在男性中口并且在未来几年中，肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCO的发病率和死亡率仍将继续攀升，至2040年全球肾癌死亡人数估计高达30多万.肾细胞癌可以被分为不同的分子和组织学亚型F.透明细胞癌，乳头状肾细胞癌和嫌色细胞癌是肾细胞癌中最常见的亚型090%),而剩余的亚型<10心重要的是，每种亚型在预后和治疗方面都具有特异性Iq由于缺乏早期症状，大量肾细胞癌患者在发现时己经有远处转移，手术治疗困难。因此，药物治疗对于大多数肾细胞癌患者非常重要。近年来，随着技术的进步和国内外研究者的不断努力，不断涌现出许多有潜力治疗肾细胞癌的新疗法，例如针对哺乳动物雷帕霉素靶点(mT0R)和蛋白酪氨酸激酶(RTK)信号的靶向治疗团.最近，基于免疫治疗的新策略也被开发出来，旨在针对癌症免疫细胞之间的相互作用(免疫检查点抑制剂)，这种方案在RCC治疗中取得了一些成功。虽然使用免疫治疗的患者生存率明显高于单独化疗，但总体预后仍较差。因此，迫切需要找到一种新的、有效的抗肾细胞癌的药物。己有证据表明，一些天然产物具有确切的治疗作用，如抑制细胞增殖，诱导凋亡和促进线粒体损伤，促进氧化应激""。黄杨碱(CyCIOVirobUXineD,CVB-D)是一种生物碱，来源于中国黄杨和其他同属植物。己发表的研究表明，CVB-D能通过CTHRCl-AKT/ERK-Snail信号通路抑制结直肠癌的发展0。此外，CVB-D在胃癌细胞、乳腺癌细胞中都有一定的抑制作用m叫综上，目前CVB-D的抗癌作用和详细机制较为复杂。而CVB-D对肾癌的具体作用及机制尚不明确。随着生物信息学领域的发展，网络药理学在药物发现及其设计过程方面有了显著的进步"使得网络药理学的预测结果可为新药研究的进一步研究方向提供理论依据。因此，本研究首次采用网络药理学、生物信息学方法，建立靶点-疾病网络，探讨CVB-D治疗肾细胞癌的核心靶点、生物学功能、途径和机制，希望进一步明确CVB-D在肾癌中的具体作用机制，来为肾癌治疗寻找新的靶点。1 .材料与方法1.1 网络药理学与生物信息学分析1 .1.1黄杨碱的预测靶点从PharmMaPPerO数据库筛选黄杨碱的潜在治疗靶点。基因符号名称在UniPrOtKB数据库0中手动规范化.2 .1.2肾癌的潜在靶基因肾癌相关的靶基因来自DisGeNET()。搜索策略:设置关键字为"renalcellCarCinOma",物种确定为智人。1. 1.3蛋白互作网络构建为了阐明黄杨碱药物作用靶点与肾癌靶点之间的相互作用，使用Venny2.1.0在线软件0获得交集基因并绘制Venn图。然后将交集靶点基因提交到STRlNG11.0数据库(https:/),构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络模型，将生物物种设置为智人(HOmosapiens).最小相互作用阈值设置为中置信度(>0.4)。通过CytoSCaPe(3.7.2)调整并作图，再使用CytoHubba插件进一步分析网络中的Huh基因。1.1. 4富集分析使用基因本体论(GO)分析和京都百科全书(KEGG)通路富集分析用来探索生物学途径和潜在的功能。将交集靶点基因分别输入到DAVlD数据库()和KEGG数据库O,限定物种为人，设置P<0.05,分析主要的生物过程和代谢途径，并进行富集分析，保存结果，并使用微生信O在线工具将数据可视化。1.1.5核心靶点基因生物信息学分析从癌症基因组图谱(TCGA)数据集O获得肾透明细胞癌的RNAseq数据(IeVel3)和相应的临床信息。GTEx数据来自V8版本(3使用R软件v4.0.3进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。并利用基因表达分析交互分析数据集(GEPIA,)进一步分析肾透明细胞癌患者总生存期(08)与核心基因表达水平的相关性(P<0.05,其他选项设置为默认值八1.2实验验证1.2. 1实验材料和试剂人肾透明细胞癌细胞系786-0购自中科院细胞库，Caki-I皮肤转移癌购自中科院细胞库:RPMI1640培养基(Gibco),胰蛋白酶(Biosharp),胎牛血清(Gibco),黄杨碱试剂(MedCheniExpress)»CCK8试剂盒和BCA试剂盒(ThermOFiSher),EGFR抗体(ABClona1)、AKT、P-AKT、PI3K、p-PI3K(华安生物)、kactin抗体(ABcIonaIM鼠兔IgG二抗(华安生物"1.2.2细胞培养786-0和CakiT细胞在添加10%胎牛血清，10OU/ml青霉素-链霉素混合抗生素的RPMI1640培养基中培养，细胞均放置在37,5%C02湿化培养箱中。1. 2.3CCK-8增殖实验将肾癌细胞系Caki-I和786-0以2X10细胞/mL的密度接种在96孔板(每孔100L培养基)中。接种24h后，用无水乙醇(对照组)和黄杨碱20、40、60、80、100、120、140molL分别处理肾癌细胞，每个浓度包括5个重复。24h后吸去96孔板中培养基，并在每孔中加入混有10LCCK-8试剂的100L完全培养基，培养箱孵育4h后用酶标仪在450nm波长卜读取吸光度，测量细胞增殖和活力，以上实验重复3次。1.2.4细胞克隆形成实验用6孔板培养细胞，每孔接种100o个细胞。细胞贴壁后，药物干预24h;然后，将细胞置于正常培养基中10天。移去培养基，用PBS洗涤细胞两次。加入通用组织固定剂15分钟后取出。加入结晶紫染色液染色10-20min,冲去染色剂，晾干后用手机拍照。计算细胞克隆的数量。1.5.5 倒置荧光显微镜下观察细胞形态学的变化取对数生长期786-o和CakiT细胞，接种于6孔板内，贴壁培养24h后，用黄杨碱30、60M2个浓度给药，并设空白对照组，于24h后使用倒置荧光显微镜观察786p和Caki-I细胞形态并拍照。1.5.6 流式细胞术测凋亡按说明书测定细胞凋亡率。在60mm培养皿中添加约2*10、个细胞，并用黄杨碱（0、30、60M）不同浓度进行处理。处理24h后，收集细胞，在300lIL结合缓冲液中重悬，在4黑暗中用PI和AnnexinV-FITC染色约30min.结果用流式细胞仪分析。1. 2.7Westernblot检测通路靶点蛋白质表达采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测EGFR蛋白表达。取对数生长期786-0、Caki-I细胞，以5X1OS个，2mL完全培养基接种6孔板，贴壁培养24h后，弃去每孔中旧培养基，分别用黄杨碱（30、60mM）2个浓度给药，并设空白对照组，收集各组干预24h后的细胞提取总蛋白，并用BCA法测定各组蛋白浓度，经凝胶电泳、转膜、封闭后，孵育对应的一抗（1:1000）和二抗（1:20000）,显影后用ImageJ软件分析，并用目的蛋白灰度值/内参灰度值表示蛋白相对表达量.1.2.8统计学处理所有体外验证实验均至少进行3次，3次实验的结果用均数加减标准差£土s表示。所有的统计学分析都使用GraPhPadPriSmV9软件进行。以P小于0.05,认为有统计学意义.治疗组和对照组之间的差异采用单因素方差分析。2结果2. 1黄杨碱和肾细胞癌的靶向基因本研究从pharmmapper数据库中获得了136个靶点。从DisGeNET数据库收集的肾细胞癌靶点数最为2084个。2.1. 构建PPI蛋白互作网络与分析通过维恩图（Venndiagram）,共得到68个共同目标（图IA）。PPI网络由STRINGvll.0构建，并用Cytoscape软件进行可视化（图IB）。该PPI网络包括68个节点和465条边，平均节点度13.7。圆形节点代表每个蛋白质，节点大小越大，度值越高。节点之间的直线表示两种蛋白质之间的相互作用。线越粗，相互作用越强。HUb基因由CytoHUbba插件计算。利用MCC、Degree方法计算出前10个HUb基因（图IC,1D）,并将结果进行交集得到5个核心靶点基因。为ALB、IGF1、AKTLEGFR、SRCoA注：（八）表示黄杨碱靶基因（蓝色图）与肾透明细胞癌相关基因（黄色圈）交集的维恩图。（B）黄杨碱-肾细胞癌的蛋白间相互作用（PPI）网络图。（C1D）分别为HUb基因MCC分析及Degree分析图1黄杨碱与肾细胞癌的交叉靶点分析2.2. 富集分析为了探究黄杨碱和肾细胞癌交集基因的生物学功能，我们进行了两种富集分析：（a）GO富集分析和（b）KEGG富集分析。黄杨碱主要参与的生物学过程包括信号转导、凋亡过程的正向调控、细胞周期的正向调控等（图2A）。分子功能主要集中在蛋白结合、ATP结合、锌离子结合等方面（图2A）。所涉及的主要通路有:癌症通路、PI3K-AKT通路、前列腺癌、癌症中蛋白聚糖、MAPK信号通路等（图2B）。PaK AM MgnMng PemMVy， ProtlM canc*MAMgnaNnopetbwey Rapl spnaiing PatfHray FCtfW9in M<at>>c o(hw*y EndOCnna rw*tanc FaXO MgriaNno pathway EGFR Iyrxwne Iunan GhiMcr BMtartceRm MgnaNng pathwayCmic CarcinoQtfWM - f«c*p«of cv*boe Lipid and a9wocteroMBfMBtcancar Gmtrtccaw Cnmr CaranOgnm - r*tn* 0y9 tpo Slgnak2 MTtwayt r9lbn PKJnPoIncy 5 Mn cent RMWnHQfiaiing pathwayB0iabt>c unlomycpathjr Enriched Pathwayscount score注：（八）GO富集分析（B）KEGG通路分析图2黄杨碱与肾细胞癌交集靶基因的富集分析2.3. 核心靶点表达与RCC的相关性分析在肾细胞癌中对ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC这5个核心靶点进行表达差异筛选和生存分析筛选，结果显示5个核心靶点中EGFR在肾癌组织中表达增高最为显著（图3A）。生存分析筛选得出高表达AKTl与肾细胞癌患者生存时间密切相关（图3B）。故推测EGFR与黄杨碱治疗肾细胞癌的作用密切相关。注：（八）核心靶基因在肾细胞癌以及癌旁组织中的相对表达量.（B）用GEPlA评估核心靶基因表达与肾细胞癌患者预后的相关性。*P<0.l图3核心靶点的差异表达和预后分析2.4. 黄杨碱对肾细胞癌786-0、Caki-I细胞活性及增殖的影响通过细胞活力测定评价黄杨碱对786-0和Caki-I细胞的毒性作用。与对照组相比，用黄杨碱（0、20M40M60M,80M,100Mx120M,140M）处理后肾细胞癌细胞存活率显著降低，且呈浓度和时间依赖性（图4A,786-。，24H,IC50:51.51M；Caki-1：24H1C50:42.19M）o且黄杨碱能明显抑制肾癌细胞的克隆形成（如图4B）,说明黄杨碱具有明显抑制肾细胞癌细胞的作用。Caki-IOaM注.（八）CCK-8法测定肾透癌细胞株在不同浓度黄杨碱作用下的细胞存活率，（B）采用克隆形成法测定黄杨碱对肾癌细胞的生长抑制作用。柱状图显示了克隆形成的定品结果。*P<OQ1,*P<0.001,*P<0.0001vs.对照组图4黄杨碱对肾癌细胞的抑制作用2.5. 黄杨碱对786-o和Caki-I细胞形态学的影响在显微镜下可观察到，空白对照组肾细胞癌细胞786-0、Caki-I正常增殖，形态饱满，细胞间连接紧密。黄杨碱30、60M组可见细胞数量明显减少，细胞皱缩且变得圆滑，悬浮细胞数量明显增多。提示黄杨碱对肾癌细胞有杀伤作用。如图5所示。786-0图5光镜观察黄杨碱作用前后细胞形态的变化2.6. 黄杨碱能诱导786-0、Caki-I细胞凋亡根据网络药理学分析结果，发现黄杨碱可能参与细胞凋亡，进而抑制肾癌细胞增殖。因此，我们采用AnneXinV-FnC/碘化丙咤（PI）染色研究黄杨碱对肾癌细胞凋亡的影响。黄杨碱处理后786-0和Caki-I细胞早期和晚期凋亡增加（图6A）,与网络药理学结果一致。此外，我们还研究了BaxBcl-2的表达，因为它在细胞凋亡中发挥着众所周知的作用。Westernblot结果显示黄杨碱处理786-0细胞后，抗凋亡的Bcl-2表达降低，促凋亡的BaX表达增加（图6B）。-土 UMi m l30re 30 252015105 O 0 8 6 4 2 0 £)=8。一2dod< z-0Bx吕 & 786-o=Caki-1口 Caki-1注（八）流式细胞术检测黄杨碱处理后各组细胞的凋亡水平C右侧为细胞凋亡率C*P<0.05*P<0.01,*P<0.001VS.对照组。（B）WeStemblot法检测黄杨碱处理肾癌细胞中Bax和Bcl-2的表达。图6黄杨碱对786-0和CakiT细胞凋亡的影响2.7. 黄杨碱能抑制肾透明细胞癌中EGFR、p-PI3K.pAKT的表达黄杨碱作用786.o和Caki.l细胞24h后，与空白对照组比较，60M组786-0和Caki-I细胞的EGFR、P-PI3K、P-AKT蛋白表达明显下调（如图7）,提示黄杨碱对EGFR、p-PI3K、pAKT蛋白表达具有抑制作用。Eow ¾ U 51K一0 国XOiOAi©OUJ-I0J.工WIXVd % o- >3:质3 如注条形图显示了EGFR、p-PI3KP13KsP-AKT/AKT表达的定量结果i>*P<005-P<OQl*P<0001VS.对照组图7WeSteInblot检测黄杨碱处理786-0和CakiT细胞后EGFR、p-PI3Kxp-AKT的表达。3. 讨论肾细胞癌是最常见的癌症之一，通过手术治疗，局限性肾细胞癌预后较好，但实际临床工作中，大多数病人常常在诊断时己是转移性肾癌。转移性肾细胞癌治疗难度大，主要因耐药而反应率低，预后差.，常规临床治疗效果不理想。因此，迫切需要新的治疗方法和药物。黄杨碱具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性。且黄杨碱对多种癌症都有抑制作用，包括结直肠癌回、胃癌"0、乳腺癌、肺癌g)等。虽然许多研究都提出黄杨碱的抗肿瘤活性，但黄杨碱在肾细胞癌中的详细机制尚未完全阐明。在本研究中，我们通过黄杨碱和肾癌靶基因取交集得到68个基因。基于网络药理分析构建肾细胞癌与黄杨碱之间的蛋白互作网络，收获核心靶点基因ALB、IGF1、AKTl.EGFR、SRCo生信分析结果显示，EGFR在肾癌组织中高表达，ALB、IGF1、AKTI在肾癌组织中低表达，而生存分析显示AKTl低表达的患者总生存期较短。ALB、IGFhAKT1、EGFR、SRC参与多种肿瘤发展和信号通路。这也表明黄杨碱可能是通过作用于以上靶点从而对肾透明细胞癌发挥直接或者间接的调控作用。表皮生长因子受体(EPidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是ErbB家族酪氨酸受体激酶的成员之一，在促进细胞增殖、对抗细胞凋亡方面发挥着重要作用"'"。EGFR的扩增和突变己被证明是许多癌症的驱动因素，如非小细胞肺癌2、肾癌W和基底样乳腺癌.。例如，Smith等发现EGFR可能是hif-2a依赖性肿瘤发生的关键决定因素，也是VHL肾癌治疗的可靠靶点间。有报道称，下调EGFR可促进肾癌细胞凋亡，抑制细胞的增殖")，且本研究生物信息学分析表明EGFR在肾透明细胞癌中高表达且表达差异较高，故我们推测黄杨碱可能通过调控EGFR来对肾癌细胞起作用。本研究首次利用网络药理学和生物信息学，具体分析了黄杨碱治疗肾透明细胞癌的分子机制。GO和KEGG富集分析表明黄杨碱治疗肾透明细胞癌的关犍靶点主要涉及凋亡、增殖、自身磷酸化、炎症反应等生物学过程和PI3K-AKT、MAPK、RaPI等信号通路。通过上述分析提示黄杨碱可能通过EGFR-PI3K-AKT通路诱导细胞凋亡在肾细胞癌中发挥作用。体外实验进一步证实黄杨碱能抑制786-o和CakiT细胞活力，促进细胞凋亡，且呈剂量性依赖性，与网络药理学结果一致。此外，实验发现黄杨碱处理后肾痛细胞系786-0和CakiT中EGFR的表达降低且磷酸化PI3K、AKT表达降低。因此，我们推测黄杨碱可能通过调控EGFR的表达抑制PI3K-AKT的磷酸化诱导肾癌细胞凋亡从而抑制肾癌细胞。当然EGFR具体通过什么机制调控PT3K-AKT通路还需要后续研究进一步验证。总之，我们通过网络药理学、生物信息学分析和体外实验验证，财黄杨碱对肾细胞癌的作用及机制进行预测和验证，表明黄杨碱可能通过多靶点、多途径调控肾细胞癌的进展。进一步的体外实验，首次证实黄杨碱可能通过抑制EGFR-P13K-AKT通路来促进肾痴细胞凋亡，在肾细胞癌中发挥重要作用。为后续深入研究可能的作用机制做出了铺垫，也为未来学者们探索防治肾细胞癌的进一步研究提供了新的思路。参考文献11 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