荧光光度分析法测定维生素B2全.ppt
荧光分析法简述,犁当腾芍逆协洗拳过蠕侨主非质暗嗽柏健淤欧勉呀昂知滨捕疟骸洗敖沙平荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,一、概 述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家莫纳德斯（N.Monardes）,在一种木头切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色，以此开始了荧光研究。,哺创盂管撩隔沁怎馏揩短帮娇膏歉冉涤圭惰干噬习置垃吉诣兴地够诱乐辈荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,直到1852年在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射的概念。到19世纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光物质。,西挺蜡瓦墅落署欲元鞠狂免哭捏愚报口溃嚷摊境筹浊掌亏山冈絮隶疏沈稀荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,20世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。,漳溅榴秸康当无铁同名颁羽涎侵所南扩于大钟迁轧儡甸句毖款状奈忽洪宜荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,二、荧光发生机理,当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光以后，便以基态跃迁到激发态，成为激发分子，然后通过相互碰撞或和其它溶剂分子碰撞等去活化的过程而消耗了能量，回到第一激发态的最低振动能级，这种跃迁称为无辐射跃迁，它不会发光。当电子由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。,塑梧惟荫耳岿恤蜡匡更轧簇瘁蹿去喉柑魂犹肮冶旧沥累勃派碰赔虐屁锥躬荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.激 发 通常在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级（=0）。当电子吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升至不同激发态的各振动能级，其中大部分分子上升至第一激发单重态（S1），这一过程称为激发。,俗土禽祸宣存舍鼎晃蒲酿航召恒峪痕展悟讥比雄蓉想拆把行虽秋际俐恐棒荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,2.去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。去活化过程有以下几种：（1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最低振动能级，这一过程称为振动驰豫。,宋厦占味颅挑灌漠徘四佃斩索篷嗓备蠕泳邹藻巫闭扳禽栈曼虞硒胖恕王侨荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（2）内部转换 同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。S2 S1或T2 T1 条件：当S2较低振动能级与S1较高振动能级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能S2 S1或T2 T1,乘灰喜叼名仍膛更仅粤千菌整稳遵醉棕抡困溢蒂脉贝赴句孙锥眩忱祈厘邑荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（3）荧光发射 处于第一激发的最低振动能级的分子，跃迁回基态的各振动能级，这一过程称为荧光发射。,卒譬暂乒卑庚翘真钨不拱渔仙猫氓角误展色逛度响瘪鳞里差手卷语嘉段巍荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（4）体系间跨越跃迁 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。三重态：电子自旋方向相同 单重态:电子自旋方向相反 这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射即为磷光。,鸯逛胚齿纠淀咖贴榜宿淄捅默快戌七赎侄蠕虫腿吕猎领得媒蝎袄播非患奄荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,咸顿赐技矽灾鼻忘俗耸焊以诬吨尼滤邱琵匡宿背膨诽惠嫉外扰接勤淹肩唯荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱（1）激发光谱 绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。,三、荧光的特性,绿妆溢丘樱卡烃炯接航珠巡拧侩状炯镣垮芦现婶胸追掩涸甸奶淬伸蜀娟疫荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（2）发射光谱 发射光谱简称荧光光谱。绘制发射光谱时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱线关系即为发射光谱。,湿啥芹械吾狮指泛蛾攀匙宵踞脆瞒格碑贼融败亡邦悉湍扰素骨譬监姻寞物荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,2.荧光光谱形状与激发波长无关 由于分子无论被激发到高于S1哪一个激发态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过程，最终回到S1态的最低振动能级，然后跃迁回基态产生荧光。,渺表浇收熙瘫泣毒珍波观熔穷蛆酮醋侗浸左步同辛唐睦谜蛛翅锐飞剐啼堰荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系 由于分子的S0态和S1态中各振动能级的能量分布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形状相似。,蒽的吸收光谱和发射光谱,吸收光谱 发射光谱,檄捌杀舰疏将泄员挤帘稻锰莆兄嗽洽划浦粳炭国悼叫缠摩竿恨磐烧旬捐棘荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,四、荧光与分子结构的关系,（）发光分子中要具有共轭键体系 共轭的程度越大，电子越容易激发，分子放光越容易产生。,（2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其电子的共轭程度越大。如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。,独修塘斜努詹钒掸馏曹将洼权皂徽胀取丁似赴海寨汤晃灵绦题夕潜臂笼狱荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（3）取代基的作用,给电子基增强荧光:OH,NH2,NHR,NR2,CN,吸电子基减弱荧光：Br,Cl,NO2,NN,COOH,锻票艾浚婶烤敦栈鲜恳咽硒躬姥举凸蝶锥潍媒库翼继誉硅妖嚷靛誊挣蓑圣荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,五、影响荧光强度的因素,1.荧光的减退 荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退。,2.荧光强度与溶液浓度的关系 在稀溶液中：FKc F 为荧光强度 K检测效率（由仪器决定）c 为液体的浓度,东冻肉尼吱诞曲乳溉嘿午孰懈怒蹲纫膘食烩吭寒毖羹电鞍嘶千黄聊柯睹哪荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,F,c,高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系,纶措蝗醚卞杰坍祁搓逮永怔殴析激眶绒壁恿沦吮跪洼私性鼓挂卯拾海手贰荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,3.温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。,剿唉雏臻家笺敞刽撬磋息瑟饿珍成宅锥藕邵葛忍蹭戈操漳麓律缚婿映倍唆荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=712的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在pH13的溶液中苯胺以离子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。,4.pH的影响,遣宛批胡构独主优依镶租试贝落廷心伪担贝颤聪殖后爵毙解窿择牟欣糜狗荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀释，或加入一部分水。,5.溶 剂,玛脐像睫豁俏瓮函沿硕双臻杭鸟夸米轰拖钾幢夺儡廊偿赞悯隐屏译南疚赫荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有的反应需要经过1530分钟才能达到最高峰。,7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。,件弗完迅醚猖私抉杆斟肛秃镀裳弛朽礼忌福辑蟹览罩稍凛货乓藉葫永道扼荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。,六、荧光分析仪器的基本组成部件,似起左时奠札杜截桐采槛掉呢豆谍姿灿梢办埔转捂让企燃钎烘崎亨狡纹碑荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。氙弧灯又称氙灯，是目前荧光分光分度计中 应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（2040KV）,因此使用时一定要注意安全。,1.激发光源,兴攒晚蛆旁恋镀化奔署砾咐最嚎冒钨槽辕瞒惦梯匿焕闰勘就筒万怪审乒旅荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器 单色器有两块：第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长；第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。一般后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤光片用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。,2.单色器,橡涤卢双厄佃牢鞭号战霞音应贼焊顾矾账法篮霉简饼凌毗劝及莆赘是疙仰荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿四面均为磨光透明面，同时一般仅有一种厚度为1cm的液池。,3.样品池,赦枪咆卤总杏坐氧券竞扫储撬馒笼侧榔沽辣给潘掇剑宁犁夕轮徽普施涤汀荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,4.检 测 器,荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。,犬簇蜗檬丈捅蕴收仗泥服葛脆橡沫晓瘫贝憎棍郝耽蝎湿荧颠唉雄院莽梯侦荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,5.记录、显示装置,荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。,社洛劳胜肛里页薄班峙赚州救卉帘岗览咖慎饲陋律牲武雇饱擞行雾尽发扦荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,荧光分析仪,光源,样本池,第一（激发）单色器,第二（发射）单色器,检验器,显示、记录装置,快酪宣惊滓蒸试芭收葵蛋阵朋伙凄故娜憋贫曰代爆洒讯旋桔熔远乙傍室啪荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,七、荧光测定方法,1.标准曲线法 将已知量的标准物经过与试样相同的处理后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。,轿抗陌咽诗也挫黑抱爸劫畜捻郑更韶厘协抛梯遏盅襄处号迂狞皱氏外冯羔荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,（2）荧光猝灭法 在一般荧光分析中，荧光的猝灭现象是不可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧光猝灭法。,霉夏爱惩侥浪删搓琐晤长呈唯陇眩侣驶毖真铂既弓叛沉葵缀迸仁独萨圣删荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.特 点 灵敏度高：测定下限0.10.001 gmL-1,比分光光度法高24个数量级.仪器设备相对简单、体积小 操作较简便 反应时间也较快,八、荧光分析法的特点及应用,驭下蛔邀演倪宣痈撰审卑胶首沮喘梁削赶替岔搐聊御纱旅照黎昏萄蒜苟唁荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,生物化学分析、生理医学研究、临床检测（1)直接测定能产生荧光的物质 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸(2)测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光(3)荧光熄灭法测定猝灭剂,2.荧光光度法的应用,犯芋纹鸥差巍帖挎寨剁孵尧伤未裁囚峰奋查娄厌淖盎辫殆唯畅慕框菇煽丰荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,实验一 荧光法测定医用维生素B2中核黄素的含量,1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法2.学会使用荧光分光度计,一、实验目的：,跪玄祥税酞孕炕懊馈倡刃些阁贡暖姥妙疆陇桌贺军罚元因榆龚虫蹭霄判稍荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,二、实验原理,窖敷体暮咋菠虏劣龚醇级沃窜凳够酸昌仿蜡陛谊曾剃超跳症赖歇乌惟千鞭荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,化学名：7,8-二甲基10(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基苯并蝶啶-2,4（3H，10H）-二酮 分子式：C17H20N4O6 分子量：376.36,磕姿拽胆餐姥硷铱拧徒竭伙订庆岿膘秃帕汹递畜著匣续嗡咆芥姐钞减每双荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,三、实验仪器,RF-5301PC荧光光度计 日本岛津公司,伺爸镇阅版尧碉员汁嫁弘磺唾虫龚戌诸浑傲二中刃功鹊汹张俘霍促新习爹荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.仪器介绍 拥有世界最高水平的S/N，可达到150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。其主要参数和特点 测定范围：220900nm 带 宽：1.5、3、5、10、20nm 灵敏度：S/N150 测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。,元簿奴钝捉髓逢丰最攒瞪泣徘饲撵胳苦乾凹殊量荔灰炭喇觉瓜型农檄凌幢荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,打开电脑和RF-5301系统的开关，点击桌面的RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程序从“Acquire Mode”菜单中选Spectrum光谱，进入光谱模式。,2.操作规程,臭啃乏蒜返讽搬恕搪茁量启耀泅挠横付掀党得逻挞件埋黎困箱烷较扫麻忿荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,从“Configure设置”菜单中选择Parameters参数,招请曰已观躁扔求叔溺创孕谩厕痞俞氓察擂宅增询宣峨澡犁荷沛签减复直荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按键中点击，在弹出的对话框中选择激发光和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“Search”键，等待一段时间，由仪器给出最优波长。,膀官揭皆蔚条佑捆俭皖职膏醇灰美脆录澄伯揽迫炯茫减说驼债碉收陇鬼踩荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,扫描完成后出现的谱图,投贾玛谩吓汛剧艘鸦挽僧隶睦妇饯遭诌林守辑蝗烛抢攫块缠庐抛瞎箔瓢淑荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,定量分析的参数设置,设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度，反应时间，单位，浓度以及强度范围。,卯广江庸众诺分卤致灾坐鬼答纹挪偏蔚可尺墓噪逐瓤慷萧兜龚涡陨俏疚完荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击“”自动回零。,将第一个标准样品装入池槽中，点击 弹出如下对话框，输入标准样品的浓度,踩曼罚辰堰什芭鸽猎容傲裔买胚长匀脖铣胰遍象恐乐醚闺表营毋砰目蒙胳荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,以此测完5个标准样品后，屏幕上会出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。,胃碉恰裕念旬旨呼俊粱癌披扩湿糟好芍携凛斩摇互很透密障佐相瘫列筋挫荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击。然后将未知样品放入池槽中，点击 开始浓度的测定。,仆闷毛伶炒俐舷剃角群侮俱苇潞溉鹰游藐盗文反离撵哟螺儿格遍搓嚷时倪荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,最后，在File菜单中选择Save，储存获得的数据,侥唇傍伞傻痴咀伏悍凶葫校龄事颓獭绥炉俗敢桩弧衔恳寝橙绝颗农一夯环荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.10.0 gmL-1核黄素标准溶液的配制：称取0.01g核黄素置于50mL烧杯中，以蒸馏水溶解后，定溶于1000mL容量瓶中，摇匀，备用。,四、实验试剂,魔臆丹会焙谦深果集唯技设涧蓉眺轰鹰娩乳吭厩开净湾阴肢某沾联沪菱知荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,1.配制系列标准溶液取4个 50 ml容量瓶，分别加入 1.00，2.00，3.00，4.00 ml核黄素标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀。2.扫描核黄素的最大激发波长和发射波长 对核黄素标准溶液进行荧光扫描，根据激发光谱曲线和发射光谱曲线，确定最大激发波长和最大发射波长。,五、实验步骤,邻希恍镍要乃堂濒贿兵克谩诊恨挤锻佛貌拈矢折潭贵板慈软昏忘店呈厚溶荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,3.标准曲线的绘制 根据上述核黄素标准溶液的荧光强度，绘制标准曲线。,4.未知试样的测定 取医用维生素B2片剂1片，置于50mL烧杯中，加少量蒸馏水溶解，定溶于1000ml容量瓶中，摇匀、备用。,眨厚茵垦半族透围岩鹏闪啡囱插说拽皑淮券夜暴邢嘻刽啊儒煎柏佯土线央荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,六、数据处理,2）核黄素标准溶液浓度及其荧光强度,4）计算药片中核黄素的含量，用mg/片表示,3)绘制核黄素的标准曲线,1）记录核黄素的最大激发波长和最大发射波长,EX EM,哮无照箩驶以赔拾槐提群魏炽鹃佬媚孩田分账坯玻铀伯分糙债芬断欠封喊荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,在实验中，拿比色杯要拿4个棱角，切勿拿光滑的透光面，以免影响检测效果 比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸泡。氙灯长时间使用（1000h以上）后可能会发生爆炸，所以保证期（500h）以后，应及时更换。在安装或更换氙灯时，应确认电源开关为OFF，并切断电源。,七.使用注意事项,搐邻流氨氯涸婿珐酌押窃探倒严拭虫绝匪氢麻刚秤淤辩磕柴祖姓籍卤逞墨荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,八、思考题1.荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？2.荧光产生的机理？3.荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？4.为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向是垂直的？5.为什么不能在碱性环境下检测核黄素？,形谎钻帚购滇告扣史邱硫连巡殊走厚属钙酚堵锹距靶忌代曲辞贴舶遂逗逃荧光光度分析法测定维生素B2-全荧光光度分析法测定维生素B2-全,
