蛋白质的共价结构-教学用.ppt
,蛋白质是生物功能的主要载体：,蛋白质的共价结构,第 4 章,一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次三、肽四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,教学内容,一、蛋白质分子的大小,蛋白质Mr的范围：6 000 1106，下限一般认为从胰岛素（Mr 5 733）。肽、蛋白质的一般区别：,一般情况，少于 50 个 氨基酸残基的低分子量 氨基酸多聚物为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽；多于50个氨基酸残基的称为蛋白质。有时把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。多肽一词着重于结构，而蛋白质原则强调了其功能。,一、蛋白质分子的大小,单体蛋白、寡聚蛋白或多聚蛋白、亚基超分子复合体,对简单蛋白质，用 110 除它的 Mr 即可约略估计其氨基酸残基的数目。蛋白质中 20 种基本 aa 平均 Mr 约 138，但多数蛋白质较小氨基酸占优势，平均 Mr 接近 128。形成一个肽键将除去一分子H2O)，所以氨基酸残基的平均 Mr 约为110,一、蛋白质分子的大小,氨基酸残基数目的估算,一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次三、肽四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,教学内容,二、蛋白质结构的组织层次,一级结构：多肽链的氨基酸序列，包括共价键。二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如螺旋、折叠等元件。三级结构：借助次级键形成特定走向的球状实体.四级结构：亚基借助非共价键彼此缔合成寡聚或多聚蛋白质.,一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次三、肽四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,教学内容,(一)肽和肽键的结构(二)肽的物理和化学性质(三)天然存在的活性肽,三、肽,肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物.肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键(酰氨键),氨基酸氨基酸残基.二肽：两个氨基酸，寡肽:2-10个氨基酸，多肽多于10个氨基酸.,（一）肽键的结构,（一）肽键的结构,多肽链主链：肽链骨架由-N-C-C-重复排列而成,（一）肽键的结构,酰胺氮上的孤对电子与羰基O之间的共振作用,形成共振杂化体,稳定性高.肽键具部分双键性质，不能自由旋转,具平面性.个原子几乎处在同一平面内(酰氨平面)。有的40%的双键性质，CO 有40%的单键性质。肽键亚氨基在pH014内不解离.肽键一般是反式构型，而Pro肽键可能出现顺、反两种构型,肽键的结构特点：,短肽以偶极离子形式存在。pH 014，亚氨基不解离，酸碱性取决于端-NH3+和端-COO-以及侧链上可解离的基团。-羧基，-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。凡有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应。旋光性:一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和;蛋白质水解得到的各种短肽,只要不发生消旋作用,也具有旋光性.,（二）肽的物理和化学性质,先分别判断各解离基团带电情况,再统计净电荷的量,（二）肽的物理和化学性质,肽 pI 的计算:,从模型化合物获得数据推测的多肽连可解离基团的pKa值,pI=1/2(4.5+7.8)=6.15,（三）天然存在的活性肽(自学),以四肽甘氨酰 谷氨酰赖氨酰丙氨酸的酸碱性质分析,一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次三、肽四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,教学内容,四、蛋白质测序的策略,测定多肽链的数目:单体蛋白或同具体蛋白含一种多肽链;杂多聚蛋白含多种多肽链；拆分多肽链:非共价结合,用变性剂如尿素,盐酸胍或高浓度盐;多肽链之间有二硫键(胰岛素),用氧化剂或还原剂；多肽链内二硫键的断裂:在步骤4 之前断裂,否则影响后面的测序；,分析每一条多肽链的氨基酸组成:酸水解、碱水解或酶解；鉴定多肽链的N-末端和C-末端氨基酸残基:鉴定两个末端，作重建肽链氨基酸顺序的参考点；用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段；测定各肽段的氨基酸序列；拼接各肽段成完整的多肽链；确定二硫键的位置。,四、蛋白质测序的策略,一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次三、肽四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,教学内容,(一)末端分析(二)二硫键的断裂(三)氨基酸组成的分析(四)多肽链的部分裂解(五)肽段氨基酸序列的测定(六)肽段在原多肽链中的次序的确定(七)二硫键位置的确定,五、蛋白质测序的一些常用方法,(一)末端分析,1.N-末端分析,DNP-多肽经酸水解后,只有N-末端残基变成黄色的DNP-氨基酸；DNP-氨基酸经有机溶剂提取，用层析法鉴定,2.羧基末端分析：采用羧肽酶法,丹磺酰氯（5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯）,2,4-二甲基氨基-偶氮苯-4-磺酰氯,N-末端分析的试剂还有：,（二）二硫桥的断裂,一般用酸水解：6 mol/L HCl，1101024 h，Trp 破坏，Ser、Thr、Tyr也被破坏,程度与保温时间有线性关系;辅之以碱水解:5 mol/L NaOH,110,20 h;氨基酸自动分析仪；表示方法：一般用每摩尔蛋白质中所含的氨基酸残基的摩尔数表示.,（三）氨基酸组成的分析,（四）多肽链的部分裂解,胰蛋白酶：R1=Lys或Arg（专一要求）；R2=Pro（抑制水解）胰凝乳蛋白酶:R1=Phe、Trp或Tyr（水解速率快）；R2=Pro（抑制水解）胃蛋白酶：R2=Phe、Trp、Tyr或Val等疏水残基（水解速度快）；Rl=Pro（抑制水解）葡萄球菌蛋白酶:Rl=Asp或Glu溴化氰（CNBr）：Rl=Met,肽段用凝胶过滤、凝胶电泳和 HPLC 等方法分离,(五)肽段氨基酸序列的测定,Edman 化学降解法,(六)肽段在原多肽链中的次序决定,（七）二硫键位置的确定,六、根据基因的核苷酸序列推定多肽链的氨基酸序列,用对角线电泳法,胰岛细胞分泌，前胰岛素原内质网腔酶切信号肽（N-端约20个残基）胰岛素原 高尔基体酶切连接胰岛素B链C端和A链N端连接肽(C肽,约30个残基)成熟胰岛素1953，Sanger F 等首次完成了胰岛素的全部结构测定工作,七、蛋白质一级结构的举例,胰岛素(insulin):,欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。,八、蛋白质序列数据库,九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成,保护基应具备的条件：,起到保护作用；易除去而不引起肽键断裂,9-芴甲氧羰基,去保护基,连接,活化,作业题：第4、7、8三题,基本要求：,掌握肽键的结构特点掌握肽的理化性质掌握蛋白质测序的一些常用方法,可以书山有路勤为径，不要学海无涯苦作舟！,
